2.2.1 생물량 측정을 위한 세포밀도의 산출

시료의 세포 수는 혈구계수기(Marienfeld counting chambers with V-slash)와 광학현미경(Zeiss, Axioscope 2.0)을 사용하여 400배의 배율로 직접 계수하였다. 세포밀도는 아래의 식을 통해 계산하였으며, 천의 자리에서 반올림하여 산출하였다. 세포밀도는 각 시간별 채수한 시료를 3회 반복 계수하여, 이를 평균값으로 제시하였다.

C=계수된 개체수의 합

A=혈구계수기 면적 (mm²)

D=혈구계수기 깊이 (mm)

N=검경한 시야의 횟수

2.2.2 M. aeruginosa의 사세포 염색

M. aeruginosa의 세포 사멸률을 평가하기 위해 Erythrosin B (CAS No. 16423-68-0)를 사용하여 사세포를 염색하였다. Erythrosin B는 세포막이 손상된 사세포를 선택적으로 염색하여 광학현미경을 통해 생세포와 사세포를 구별할 수 있게 한다. 본 연구에서는 ^{Calomeni et al. (2015)}와 ^{Franke et al. (2020)}의 연구를 참고하여 0.2% Erythrosin B 용액과 M. aeruginosa 배양세포 현탁액을 1:1 (v/v) 비율로 혼합 후 50분간 염색하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Microscopic photographs of M. aeruginosa cells mixed with a 0.2% Erythrosin B solution to confirm cell death. (a): stained dead cells of M. aeruginosa. (b): unstained live cells of M. aeruginosa.

2.2.3 세포 염색법을 통한 세포 사멸률의 산출

세포 사멸률 측정을 위해 Erythrosin B를 이용한 세포 염색법을 적용하였다. 염색약과 혼합한 1 mL의 시료를 혈구계수기에 주입한 뒤, 임의로 선정된 400배 배율의 현미경 시야에서 15분 이내에 500개 이상의 세포를 계수하였다. 이 과정에서 염색된 사세포와 염색되지 않은 생세포를 구분하여 계수하였다. 세포 계수 시, UV-C 조사로 인해 세포막의 형태를 온전히 유지하지 못하거나, 세포 내부의 색소가 탈색된 세포도 사세포로 간주하여 계수하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Microscopic photographs of M. aeruginosa cells that have lost structural membrane integrity or exhibit intracellular pigment loss following UV-C irradiation.

세포 사멸률은 단위 부피당 계수된 전체 세포 수 중에 염색된 세포 수의 비율을 계산하였으며, 세포 수를 천의 자리에서 반올림하여 산출하였다. 각 시간별 채수한 시료를 3회 반복 계수하여 세포 사멸률을 구하였으며, 이를 평균값으로 제시하였다.

2.3.1 UV-C를 이용한 M. aeruginosa의 직접 세포사멸 실험

UV-C가 M. aeruginosa의 세포 사멸에 미치는 직접적인 영향을 확인하기 위해, 초기 세포 농도 1,000,000 cells mL^-1의 M. aeruginosa 배양세포 현탁액 4 L에 UV-C를 조사하였다. UV-C 조사는 총 10분간 진행하였으며, 1분 간격으로 각 조사 시간(0∼10분)마다 수조 중앙을 기준으로 9.4 cm 간격의 3개 지점에서 각각 1 mL씩 시료를 채수하였다. 채취한 시료는 균등하게 혼합하여 분석에 사용하였으며, 채취 직후 1시간 이내에 세포 사멸률을 측정하였다.

2.3.2 장기 생장 억제 실험

UV-C의 장기적인 생장 억제 효과를 확인하기 위해, 동일 조건(초기 세포밀도 1,000,000 cells mL^-1, 4L, 동일 램프 및 교반기)에서 UV-C를 실험 시작 전 2분 및 5분씩 1회 조사하였다. 이후 19일 동안 배양하였으며, 24시간 간격으로 시료를 채수하여, 세포밀도와 세포 사멸률을 각각 측정하였다. 세포 사멸률은 동일하게 Erythrosin B 세포 염색법과 혈구계수법을 이용해 산출하였다.

3.2.1 대조군의 생물량 변화

실험 1일 차에 사세포 염색을 통해 대조군의 세포 사멸률을 측정한 결과 1,000,000 cells mL^-1의 세포 중 32,000 cells mL^-1의 세포가 사멸하여 3.2%의 세포 사멸률을 나타내었으며, 이후 점차적으로 증가하여 실험 18일 차에는 약 1,800,000 cells mL^-1의 세포 중 약 1,570,000 cells mL^-1의 세포가 사멸하여 실험 기간 중 가장 높은 86.5%의 세포 사멸률을 나타내었다(Fig. 5). 특히, 실험 7일 차에서 11.1%였던 세포 사멸률은 8일 차에 32.6%로 급격히 증가하여 실험 기간 중 가장 큰 증가 폭을 보였다. 한편, 대조군의 세포밀도는 실험 4일 차부터 12일 차까지 2,000,000 cells mL^-1 이상을 유지하였다(Fig. 5, 6).

세포 사멸률이 급격히 증가했음에도 불구하고, 세포밀도가 일정 수준 이상으로 유지된 것은 세포밀도 산출 과정에서 생세포와 사세포를 구분하지 않고 전체 세포 수를 계수하여 실험 초기부터 축적된 사세포가 세포밀도에 포함되어 실제 생물량과 차이를 보인 것으로 판단된다.

Fig. 5. Changes in cell death ratios of control and UV-C treated samples over 19 days of cultivation, with UV-C initially irradiated only once.

3.2.2 UV-C를 2분간 1회 조사한 실험군의 생물량 변화

UV-C를 2분간 1회 조사한 실험군의 세포 사멸률을 측정한 결과 UV-C 조사 직후 초기 세포밀도인 1,000,000 cells mL^-1의 세포 중 58,000 cells mL^-1의 세포가 사멸하여, 5.8%의 세포 사멸률을 나타내었다. UV-C 조사 직후 M. aeruginosa의 세포밀도는 급격한 변화를 보이지 않았는데, 이는 UV-C 조사에 의한 세포밀도의 변화가 즉각적으로 나타나지 않은 ^{Ross et al. (2006)}의 결과와 일치하였으며, UV-C에 의한 세포 손상이 즉각적인 세포밀도의 감소로 이어지지 않았음을 나타낸다. 이에 단순히 세포밀도로만 녹조 현상 제어 효과를 판단할 경우, UV 등 스트레스 처리 직후의 효과를 과소 또는 과대평가할 수 있다고 판단하여 세포 염색법을 이용해 사세포와 생세포를 구분하여 보다 정확한 생물량을 구하고자 하였다.

실험 2일 차에는 11.0%, 3일 차에는 10.7%의 세포 사멸률을 나타내었으며, 실험 3일 차까지 1,000,000 cells mL^-1 이상의 세포밀도를 유지하였다. 실험 4일 차부터 671,000 cells mL^-1이하로 세포밀도가 급격하게 감소하였으며, 78.7%로 세포 사멸률이 증가하였는데, 대조군과 실험군의 세포밀도가 뚜렷한 차이를 보였다. 이는 UV 조사 3일 뒤 실험군의 세포밀도가 대조군의 25.0% 이하로 감소한 ^{Alam et al. (2001)}의 UV에 의한 M. aeruginosa의 불활성화 실험과 유사한 양상을 나타내었고, 그 원인을 누적된 손상이 세포의 생장 억제를 유도한 것으로 보았다.

실험 3일 차부터는 세포 내부의 색소가 탈색되거나 세포막의 형태 변화는 없었으나 사멸한 세포를 확인하였으며, 실험 7일 차에는 세포막의 형태가 변형된 세포가 관찰되었다. 이는 UV를 조사하고 3일 후에 세포가 희미해지고 7일 후에는 세포막이 손상되었다는 ^{Alam et al. (2001)}의 결과와 유사하였고, UV-C 조사량의 증가로 세포 괴사(Cell necrosis)가 일어나고, 세포 무결성(Cell Integrity)이 소실되어 시간의 경과에 따라 세포가 사멸하였다는 ^{Ou et al. (2011)}의 결과와도 유사하였다. 또한, ^{Ameisen (2002)}와 ^{Bidle and Falkowski (2004)}는 UV-C 조사에 의한 M. aeruginosa 세포막의 직접적인 파괴로 세포 무결성의 소실이 세포가 외부 스트레스에 의해 스스로 사멸하는 세포예정사(PCD, programmed cell death)를 유발한 것으로 판단하였다.

실험 9일 차에는 94.5%로 실험 기간 중 가장 높은 세포 사멸률을 나타내었으며, 14일 차에는 69.8%로 세포 사멸률이 감소하였다(Fig. 5, 6). 이는 ^{Tao et al. (2013)}이 진행한 실험에서 저선량의 UV 조사가 M. aeruginosa의 유전자 발현에 손상을 초래하여 3∼13일 동안 생장을 억제하였으나 점진적으로 회복되었다는 결과와 유사하였으며, ^{He et al. (2016)}과 ^{Sakai et al. (2005)}가 언급한 바와 같이 UV-C에 의해 손상된 세포의 회복 체계가 작용하여 생존한 세포의 일부가 회복 및 증식한 것으로 판단된다.

3.2.3 UV-C를 5분간 1회 조사한 실험군의 생물량 변화

UV-C를 5분간 1회 조사한 실험군의 세포 사멸률을 측정한 결과 UV-C 조사 직후 77.4%의 높은 세포 사멸률을 나타내었다. 세포 사멸률을 확인한 결과 실험 초기의 1,000,000 cells mL^-1의 세포 중 874,000 cells mL^-1의 세포가 사멸한 것으로 나타났다. 실험 2∼19일 차에는 90.4∼99.9%의 세포 사멸률을 나타내며 장기적인 생장 억제 효과를 나타내었다(Fig. 5, 6).

UV-C 조사량이 2분에서 5분으로 증가함에 따라 세포가 사멸하는 속도가 가속화되었다. 이는 ^{Ross et al. (2006)}의 연구에서 UV-C 조사량이 증가할수록 세포 무결성이 소실된 세포 수의 증가 및 세포예정사에 의한 세포 사멸이 가속화된 것과 동일한 양상으로 판단된다. UV-C를 2분간 1회 조사했을 때에는 14일 동안 생장 억제 효과를 나타내었으며, 5분간 1회 조사했을 때에는 실험 전 기간인 19일 동안 생장 억제를 보였다.

본 연구에서 세포 사멸률과 장기적인 생장 억제 효과를 종합적으로 고려한 결과, 5분간의 UV-C 조사가 M. aeruginosa에 대해 가장 높은 억제 효과를 나타내었다. 그러나 실제 녹조 발생 초기의 현장 적용을 고려할 경우, 수체의 체류 시간, 에너지 소모, 자외선램프의 교체 주기 등 운용상의 제약으로 인해 5분간의 연속 조사는 실용성 측면에서 한계가 있을 수 있다. 반면, 2분간의 UV-C 조사는 직접적인 세포 사멸률과 장기적인 생장 억제 효과에서는 5분 조사에 비해 다소 낮았으나, 세포 사멸률의 반등이 관측된 14일을 주기로 반복 조사할 경우 해당 효과를 충분히 보완할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 녹조 발생 초기 단계에서 수체 내에 2분간 UV-C를 조사하고, 이후 2주 간격으로 반복 조사하는 전략을 적용하면 M. aeruginosa의 대발생을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 6. Changes in cell density of control and UV-C treated samples over 19 days of cultivation, with UV-C initially irradiated only once.