1. Introduction

의·약학 기술의 발전은 인간 수명의 연장에 기여한 바가 크지만 또한 다양한 종류의 의약물질 및 개인위생용품(Pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)의 사용도 급증하였다. 뿐만 아니라 인구증가에 따른 육류소비량 증가 로 축산업의 대규모·산업화가 이루어져 생산성 향상과 질 병치료를 위한 의약물질이 다량으로 사용되고 있다.

그러나 환경 중에 유입되는 의약물질들은 기존 정수처리 기술인 응집-침전 공정으로는 제거가 어렵고(^{Adams et al., 2002}; ^{Kim and Carlson, 2007}), 산화공정(오존, 염소, TiO₂, UV/H₂O₂ 등)(^{Adams et al., 2002}; ^{Petrovic et al., 2003})이나 생물학적 공정(^{Behera et al., 2011}), 활성탄과 RO(Reverse Osmosis) 여과공정(^{Adams et al., 2002}; ^{Behera et al., 2011}; ^{Kim and Carlson, 2007}) 등에 의해 일부 처리가 가능한 것으 로 알려져 있다. 실제로 하수처리장 유입·유출수는 물론, 강, 지하수, 식수로 공급되는 정수처리장의 최종 처리수에서도 카 페인(caffeine), 설파메톡사졸(sulfamethoxazole), 트리메소프림 (trimethoprim), 린코마이신(lincomycin), 이부프로펜(ibuprofen), 타일로신(tylosin) 등이 빈번하게 검출되고 있다(Table 1).

수 ng/L~μg/L 농도 수준으로 검출되는 이러한 의약물질들 은 성장 및 생식기능을 저하하는 등 수생태 생물 뿐 아니라 인간의 건강에 영향을 주는 것으로 보고되고 있다(^{Liu and Wong, 2013}; ^{Malchi et al., 2014}; ^{Rahman et al., 2009}). ^{Pomati et al. (2008)}은 대장균, 인체배아 신장 세포(HEK293; Human Embryonic Kidney 293 cells), 에스트로겐에 반응하 는 난소암 종양세포(OVCAR3 tumor cells)를 이용하여 환경 중에 빈번하게 검출되는 의약물질의 독성을 평가하였다. 이 들은 ng/L 수준으로 존재하는 베자피브레이트(bezafibrate), 아테놀롤(atenolol), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 린코마이 신이 원핵세포와 진핵세포에 상당한 영향을 주는 것을 확인 하였으며 특히, 이러한 의약물질이 혼합되어 존재하는 경우 수 ng/L 수준에서도 세포증식을 억제하여 임산부와 신생아 에게 위험성을 나타내는 것을 보고하였다. 또한 설파디메톡 신(sulfadimethoxine)과 엔로플록사신(enrofloxacin)이 식물에 잠재적인 독성을 갖는 것으로 나타났다(^{Migliore et al., 1998}; ^{Migliore et al., 2003}).

무엇보다 잔류 항생제가 지속적으로 수환경에 유입됨에 따 라 항생제 내성 박테리아 및 유전자의 생성과 이로 인한 인 간보건에 대한 위협의 문제는 수십 년 전부터 제기되어 왔다 (^{Bonnet, 2004}; ^{Chander et al., 2011}; ^{Hasman et al., 2005}; ^{Hur et al., 2012}; ^{Neu, 1992}; ^{Persoons et al., 2011}; ^{Pfeifer et al., 2010}). 내성을 갖는 메티실린내성 황색포도구균, ESBL생 성 박테리아(Extended-spectrum β-lactamase(ESBL) producing bacteria) 등이 발현, 보고되어 왔으며 하수 및 하수슬러지 (^{Biswal et al., 2014}; ^{Chen and Zhang, 2013}), 물놀이 공간 (^{Santiago-Rodriguez et al., 2013}) 등 여전히 다양한 시료에서 검출되고 있다.

대부분의 페니실린계 항생제는 ESBL 생성 박테리아에 대 해 효과가 없는 것으로 나타났으며(^{Franciolli et al., 1991}; ^{Jones, 2001}), 2007년 WHO에 의해 인간 건강에 매우 중요 한 항생제로 승인된 세팔로스포린(cephalosporin)계 항생제에 대한 내성도 꾸준히 관찰되고 있다(^{Chander et al., 2011}; ^{Dahmen et al., 2012}; ^{Dutil et al., 2010}; ^{Ewers et al., 2010}; ^{Jones, 2001}; ^{Persoons et al., 2011}; ^{Pfeifer et al., 2010}). 세팔로스포린계 항생제에 대한 내성의 증가로 카르바페넴 (carbapenem)계 항생물질의 처방 및 사용이 증가하였으나 (^{Hawkey and Livermore, 2012}), 이와 동시에 카르바페넴 내성도 관찰되기 시작하였다(^{Hawkey and Livemore, 2012}; ^{Nordmann et al., 2012}). 이러한 이유로 페니실린계, 세팔로 스포린계, 퀴놀롤계열(Quiolone)의 항생제는 4세대, 매크로 라이드(macrolide), 테트라사이클린(tetracycline)계열의 항생 제는 3세대까지 부분 합성을 통해 내성 박테리아에 대비한 유사한 형태의 항생제가 개발되어 왔고 새로운 항생제 계열 을 개발하기 위한 지속적인 연구가 진행되고 있다(^{Fischbach and Walsh, 2009}; ^{Straus and Hancock, 2006}).

일반적으로 의약물질은 병원 및 가정에서 버려지는 폐수, 의약품 제조 공장에서 배출되는 산업폐수, 축산농가의 폐수, 가축분뇨의 퇴·액비 등을 통해 다양한 경로로 환경 중에 유 입된다(^{Andersson and Hughes, 2014}; ^{Heberer, 2002}). 점오 염원으로 분류할 수 있는 병원과 가정, 공장의 하·폐수는 상 대적으로 규제와 관리가 유용한 반면 산발적으로 흩어져 있 는 중소규모의 가축사육을 통해 발생하는 동물 배설물의 퇴 비화 비료 등은 추적 및 관리가 용이하지 않아 실태와 위험 성에 대한 검증도 이루어지지 않은 경우가 대부분이다. 특히, 검증된 효능에 맞지 않은 증상의 치료를 목적으로, 승인되 지 않은 연령대의 가축에, 기준 복용량 이상으로, 또는 허가 받지 않은 경로를 통해 획득한 의약품을 무분별하게 사용하 는 경우 잔류 의약물질의 추적이 불가능하며 먹이사슬 최상 위자인 인간이 섭취하게 되어 박테리아의 항생제 내성 증가 에 기여하게 된다(^{Oliver et al., 2011}; ^{Wegener et al., 1999}).

축산업에서는 항생제를 주로 사용하며 사료나 물에 섞어 섭취하게 하는데 대부분의 항생제는 흡수나 대사 작용을 거 치지 않은 원물질 그대로 또는 부분적인 대사만 이루어진 형태로 배설된다(^{Sarmah et al., 2006}). 또한 배출된 의약품 일부는 생물학적 활성도가 그대로 유지되기도 한다(^{Martinez-Carballo et al., 2007}). ^{Kroker (1983)}는 돼지가 베타-락탐계 (β-lactams), 테트라사이클린계, 설폰아마이드계(sulfonamides) 항생물질의 일부를 흡수하고 50~90%는 그대로 배설물을 통 해 배출하는 것을 보고하였다.

오랜 시간 우리나라를 포함한 많은 나라들이 가축분뇨를 퇴비화하여 농업 비료로 사용해 왔으나 이는 토양 및 주변 유역, 지하수까지 잔류 항생제 오염을 야기했고, 결과적으로 항생제 저항 유전자를 생성하게 되는 잠재적 위험요인이 되 고 있다(^{Martinez-Carballo et al., 2007}; ^{McArdell et al., 2003}; ^{Tolls, 2001}). ^{Dolliver et al. (2008)}는 클로르테트라사 이클린(chlortetracycline)의 경우 22~35일의 분뇨퇴비화 과정 에서 99%가 제거되는 것을 확인하였으나 모넨신(monensin)과 타일로신은 54~76%만이 분해되고 설파메타진(sulfamethazine) 은 전혀 분해되지 않는 것을 확인하였다. 이에 앞서 ^{Schlusener et al. (2006)}은 액비저장 탱크에서 4종의 축산용 항생제 반 감기를 조사하였는데 살리노마이신(salinomycin), 에리트로마 이신(erythromycin), 록시트로마이신(roxithromycin)의 반감기 는 각각 6일, 41일, 130일로 계산되었으며 티아물린(tiamulin) 은 총 180일의 관찰기간 동안 농도의 변화가 없는 것으로 보고하였다.

2015년 환경부는 항생제 저항성 박테리아에 의한 위험에 대비하고 가축으로부터 발생하는 잔류 항생물질의 거동 및 실태를 파악하기 위하여 ｢가축분뇨의 관리 및 이용에 관한 법률｣과 ｢가축분뇨실태조사의 세부 절차 및 방법 등에 관 한 고시｣를 제정·발표하였다(^{Korea Ministry of Government Legislation, 2015}). 고시에 따르면 대상지역의 축산현황과 환 경오염현황 조사를 위해 가축분뇨, 하천 및 호소, 지하수 등 의 시료를 채취, 잔류항생물질의 농도를 측정하게 된다. 그 러나 우리나라는 잔류항생물질 측정을 위한 공정시험기준이 마련되어 있지 않으며, 미국 EPA method 1694에서 HPLCMS/ MS를 사용하여 잔류의약물질을 측정할 수 있는 표준 방법을 제안하고 있으나 가축분뇨에 대한 전처리 방법을 언 급하지는 않고 있다(^{U. S. EPA, 2007}). 항생제 분석 방법을 개발한 논문들의 경우 하천 및 호소수 시료중의 잔류농도 측 정 방법이 주를 이루고 있고, 문헌에서 생선(^{Evaggelopoulou and Samanidou, 2013}; ^{Lopes et al., 2012}; ^{Xu et al., 2012}), 육류(^{Berendsen et al., 2013}; ^{Bousova et al. 2013}; ^{Tao et al. 2012}), 가축사료(^{Amelin and Timofeev, 2016}; ^{Boscher et al., 2010}; ^{Pietruk et al. 2015}) 등의 고체 시료를 대상으로 전처 리방법을 개발·적용한 사례가 있으나 가축분뇨 중의 항생제 분석방법(^{Gorissen et al. 2015}; ^{Zhou et al., 2012})을 제시한 연구는 미미한 것으로 나타났다.

따라서 본 연구에서는 고체 시료 전처리 방법 연구에서 선정한 37종의 동물용 항생제를 대상으로 선정된 물질을 고 성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 와 질량분석법(mass spectrometry)을 이용해 분석하 기 위한 액체 시료의 전처리 과정을 조사하고 향후 가축분뇨 중 잔류항생물질에 대한 표준화된 분석 방법을 수립하기 위 한 그룹별 특성을 비교하고자 한다.

2. Selection and Classification of Veterinary Antiboitcs

본 연구에서는 총설 I에서 선정된 37종의 축산용 항생물 질에 대한 분석방법을 조사하고자 하였다. 대상물질을 선정 하기 위하여 국내 가축용 항생제 판매순위를 조사하였고, 판 매량은『2014년도 국가항생제 사용 및 내성 모니터링』(^{Lim et al., 2015})자료를 인용하였다.

선정된 37종의 항생제는 최소 12개 이상의 계열로 분류되 며 계열별로 상이한 화학적 특성으로 인해 항생제 계열에 따 라 효과적인 전처리 방법이 다를 수 있다(^{Shin et al., 2012}; ^{U. S. EPA, 2007}). EPA method 1694나 ^{Shin et al. (2012)} 의 연구 보고서에 따르면 항생제를 물리화학적 유사성에 따 라 4~5개의 그룹으로 나누어 그룹별 최적 전처리 방법을 제 시하고 있다. 선정된 37개의 항생물질 중 16종이 미국 EPA method 1694에서 제안한 그룹에 포함되며, Shin et al.이 분 류한 그룹에는 15종의 항생제가 포함된다(Table 2).

EPA method 1694는 총 74개의 의약물질을 4개 그룹으로 나누어 각 그룹별 분석방법을 제시하고 있다. 전처리를 수행 하는 pH 조건(pH 2.0, pH 10.0)에 따라 두 그룹으로 구분되 며 그 중 산성조건에서 전처리를 수행하는 그룹은 LC-MS 분석조건에 따라 다시 세 그룹으로 분류된다. 비교적 많은 연구가 진행된 베타-락탐계, 플로로퀴놀론계(fluoroquinolones), 매크로라이드계, 설폰아마이드계, 테트라사이클린계 등의 항 생제가 포함되어 있으며 주로 Group 1과 2로 분류된다. Group 1과 2는 LC-MS 분석 조건의 차이로 인해 다른 그룹으로 분 류되지만 전처리방법은 산성 pH 조건에서 동일한 과정으로 진행된다.

^{Shin et al. (2012)}은 “잔류의약물질 분석방법 연구 및 실 태조사(V)”에서 의약물질 42종에 대한 분석방법을 제시하였 다. 의약물질을 물리·화학적 특성에 따라 구분한 5개의 그 룹에 pH, 카트리지, 용리액의 종류 등 조건이 다른 5가지 의 전처리 과정을 각각 적용하였다. Group I은 EPA method 1694와 유사하게 설폰아마이드계, 테트라사이클린계, 플로 로퀴놀론계의 항생제를 포함하고 있으며 산성 조건(pH 3) 에서 하나의 전처리를 적용하는데, HPLC 분석 조건에 따라 Group I-A, B, C로 세분화하였다. 매크로라이드계 항생제는 Group II로, 베타-락탐계 항생제는 Group III으로 분류되며 아 미노글리코사이드계 항생제인 스트렙토마이신(streptomycin)은 Group V로 분류되어 서로 다른 전처리과정을 수행하였다.

^{U. S. EPA (2007)}와 ^{Shin et al. (2012)}이 제안한 방법들 모 두 기존의 연구를 바탕으로 하여 항생제를 그룹화하고 분석 방법을 제시하였다. 따라서 분석 가능한 항생물질의 종류가 매우 유사하며 그 범위도 베타-락탐, 플로로퀴놀론, 매크로 라이드, 설폰아마이드, 테트라사이클린 등으로 제한적이었다. 특히, ^{Shin et al. (2012)}이 제안한 방법은 대상 시료로부터 여러 종류(계열)의 항생제를 검사하고자 할 때 수회에 걸쳐 각기 다른 전처리 과정을 수행해야 하기 때문에 많은 시간과 노동력을 필요로 하는 단점을 가지고 있다. 실제로 본 연구 에서 선정된 항생제를 검출할 목적으로 EPA method 1694 를 적용한 경우 시료 당 1회의 전처리를 통해 16종의 잔류 항생제 농도를 측정할 수 있는 반면, ^{Shin et al. (2012)}의 방법을 적용하는 경우 4가지의 전처리방법을 적용해야 15종 의 잔류항생제 농도를 측정할 수 있었다.

이러한 문제를 해결하기 위해 다양한 종의 항생물질을 동 시에 분석 가능하도록 하는 효율적인 전처리 방법을 도출할 필요가 있으며 이를 위해서 각 항생제 계열에 따른 물리화 학적인 특성에 대한 이해뿐만 아니라 전처리 과정에 대한 이 해가 필요하다. 따라서 다음 절에서는 액체 시료를 대상으 로, 선정된 항생제들에 대한 분석방법을 검토하였다. EPA method 1694를 대상 물질의 경우 제시된 방법을 우선 고려 하였으며 비대상 물질들에 대해서는 문헌조사를 통해 분석 방법을 정리, 비교하였다.

3. Pre-treatment methods of Liquid Samples

시료의 적절한 전처리는 분석과정에서 매우 필수적인 부 분이다. 특히 극미량으로 존재하는 잔류 항생물질을 분석하 는 과정에서 그 중요성은 더욱 커진다. HPLC-MS/MS를 이 용한 잔류항생제 분석 기술의 적용 과정에서 잔류 항생물질 의 전처리 과정의 핵심적인 목표는 시료중의 분석대상 물질 을 추출·농축시키고, 간섭물질을 제거하여 액체크로마토그래 피(liquid chromatography)단계에 주입 가능한 형태로 시료를 처리하는 것이다. 잔류 항생제를 측정하기 위한 다양한 방 법이 보고되고 있으나 물 시료의 전처리 방법으로는 고상추 출법(Solid-Phase Extraction: SPE)이 가장 흔하게 사용되어 왔다(^{Chitescu et al., 2015}; ^{Gros et al., 2013}; ^{Iglesias et al., 2012}; ^{Shelver et al., 2010}).

고상추출법은 일반적으로 Fig. 1과 같이 컨디셔닝(conditioning)- 시료적재-세척-추출-농축의 단계를 거친다. 고 상추출 대상 시료는 전여과(pre-filtration)하여 입자물질을 제거하고 대용표준물질(surrogate standard), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 투입하거나 pH를 조절하며 농축 시료를 후여과(post-filtration)하기도 한다. EDTA는 시료 중 의 금속이온을 착물의 형태로 제거하기 위하여 투입하며(^{De Alwis and Heller, 2010}; ^{Gros et al., 2013}) 추출법의 효율 을 평가하기 위해 추출 과정이 시작되기 전, 대용표준물질을 시료에 투입하기도 한다. 시료의 pH, 카트리지의 종류, 추출 (extraction)과 농축(concentration)에 사용되는 유기용매 및 사용량은 분석대상 물질에 화학적 특성에 따라 상이하며 보 편적으로 적용 가능한 최적 전처리조건을 도출하기 위한 다 양한 연구가 진행되어 왔다(^{Ben et al., 2008}; ^{De Alwis and Heller, 2010}; ^{Gros et al., 2013}; ^{Iglesias et al., 2012}; ^{Zhou et al., 2012}). 물 시료는 자연에 존재하는 지표수(surface water, SW)와 지하수(ground water, GW), 병원과 돼지 사육 농장의 폐수처리장 유출수(hospital wastewater effluent, HWWE; swine wastewater, SWW), 도시하수처리장의 유입·유출수 (urban wastewater influent, UWWI; urban wastewater effluent, UWWE)를 대상으로 하였고, Table 3~5에 물 시료 중 잔류 항생제 농도 분석을 위한 전처리 방법을 정리하였다.

Fig. 1. Schematic diagram of sample preparation for HPLC analysis.

Table 3. Conditions of solid-phase extraction (SPE) for the selected antibiotics in water samples and the corresponding recoveries (HWWE: hospital wastewater effluent; UWWI: urban wastewater influent; UWWE: urban wastewater effluent; SWW: swine wastewater; GW: groundwater; SW: surface water; FA: formic acid; ACN: acetonitrile; DCM: dichloromethane)

Table 4. Conditions of solid-phase extraction (SPE) for the selected β-lactams in water samples and the corresponding recoveries (HWWE: hospital wastewater effluent; UWWI: urban wastewater influent; UWWE: urban wastewater effluent; SW: surface water; FA: formic acid; ACN: acetonitrile)

일반적으로 전처리 과정에서 고상추출법에 따라 시료를 카 트리지에 적재하기 전, 시료의 pH를 조절하는데 물 시료의 pH는 수중에 녹아있는 분석대상물질의 해리 형태와 안정성, 카트리지의 충진 물질과 항생제간 상호작용을 결정하는 매우 중요한 역할을 한다. 조사 결과 시료의 pH는 1.5~8.0 범위로 나타났으나 겐타마이신(gentamycin)과 카나마이신(kanamycin) 을 제외한 나머지 물질들은 pH 2.5~4.0 범위의 산성 조건에 서 적절한 회수율을 나타내는 것으로 확인되었다(Table 3). 이 는 이미 다종의 항생물질에 적용하기 위한 분석방법을 연구 한 여러 문헌들에서도 보고되어 왔다(^{Diaz-Cruz and Barcelo, 2006}; ^{Gros et al., 2013}; ^{Seifrtova et al., 2009}; ^{Zhou et al., 2012}). 물 시료에 용존 상태로 존재하는 분자는 pKa 값 이 상의 pH에서 대부분 이온 형태로 존재하며 친수성을 나타 낸다. 이온화된 물질은 친유성(lipophilic) 흡착제를 사용하는 카트리지에 의한 고상추출법으로는 분리가 어렵다(^{Petrovic et al., 2005}). 플로로퀴놀론계, 테트라사이클린계, 매크로라 이드계, 설폰아마이드계 등에 속하는 주요 항생제는 산성 또는 염기성 작용기를 가지고 있고 이러한 물질들의 이온화 상태는 용액의 pH에 의해 결정된다. ^{Seifrtova et al. (2009)} 는 물 시료 중의 항생물질 분석 방법을 조사하였는데 대부 분의 물질은 산성 작용기를 포함하고 있어 시료의 pH가 분 석 대상물질의 pKa값보다 2 낮을 때 분석 대상 화합물이 산 (acid)의 형태로 존재하며 카트리지에서 대상물질의 분리성 능이 향상된다고 보고하였다. ^{Gros et al. (2013)}은 53종의 항생제를 대상으로 시료의 pH를 조절하지 않은 조건과 시 료의 pH를 2.5로 조절한 조건에서 Oasis HLB를 적용했을 때 회수율을 비교하여 추출 성능을 평가하였는데 전반적으 로 pH를 조절한 조건에서 높은 회수율을 나타내는 것을 확 인하였다.

그러나 Table 4에 나타낸 바와 같이 일부 문헌에서 페니 실린계와 세파로스폴린계(cephalorines) 항생제가 산성으로 산 도를 조절하고 고상추출법을 적용한 시료에서 매우 낮은 회 수율을 보이는 것으로 나타났다(^{Castiglioni et al., 2005}; ^{Gros et al., 2013}; ^{Lindberg et al., 2004}). 이러한 현상은 산성 또 는 염기성 조건 시료에서 일부 베타-락탐계 항생제들이 쉽게 분해되기 때문인데 시료 전처리 과정 중에 분해가 일어나 회 수율이 급격히 감소하는 것이다(^{Diaz-Cruz and Barcelo, 2006}; ^{Thiele-Bruhn, 2003}). 이는 중성조건(7.5, 8.0)의 pH에서 전 처리 과정을 진행한 경우 회수율이 향상된 연구를 통해 증 명되었다(^{Cha et al., 2006}; ^{Gros et al., 2013}). 따라서 페니 실린계와 세파로스폴린계 항생제를 포함하는 시료의 경우 중성조건에서 전처리를 수행하거나 물질의 분해로 인한 회 수율 저감을 최소화하기 위해 시료적재 직전에 pH를 조정 하는 등의 방법을 고려해야 할 것이다(^{Pozo et al., 2006}).

또한 모든 전처리 과정에서 카트리지에 시료를 적재하기 전, EDTA를 첨가하는 것으로 조사되었다. 앞서 언급한 바 와 같이 테트라사이클린계, 플로로퀴놀론계, 매크로라이드계 의 항생제는 수중의 다가 금속이온과 결합하는 성질을 가지 며, 항생제와 반응한 금속이온이 카트리지에 흡착되어 비가 역적인 결합을 형성하면서 전처리 과정의 회수율을 감소시 키는 결과를 초래한다. 따라서 이를 방지하고 추출율의 향상 을 위해 킬레이트제인 EDTA, 옥살산, 구연산 등의 첨가를 통한 pH 조절 단계가 필수적인 것으로 알려져 있다(^{Gros et al., 2013}; ^{Miao et al., 2004}). 이러한 이유로 금속이온과 결 합하는 성질이 약한 설폰아마이드 계열의 항생제만을 분석 한 연구들에서는 EDTA를 첨가하지 않았으며 회수율에도 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(^{Seifrtova et al., 2009}).

pH 조절과 EDTA를 첨가한 시료는 컨디셔닝(conditioning) 된 카트리지에 적재된다. 고상추출법은 기존의 액-액 추출방 법을 대체하여 환경시료 분석 시 가장 많이 사용되고 있는 추출방법이다. 고상추출법은 높은 선택성, 재현성, 적은 유 기용매를 사용한다는 특성과 짧은 추출시간, 자동화 등의 장 점을 갖는다. 다양한 종류의 충진제를 적용한 카트리지 중 Oasis HLB 카트리지가 가장 많이 사용되며 극성과 비극성 물질에 모두 높은 재연성과 좋은 회수율을 나타냈다. 일부 연구에서는 Strata^®-X(^{Chitescu et al., 2015}; ^{Donato et al., 2012}; ^{Iglesias et al., 2012}), Oasis MCX(mixed cation exchange)(^{Calamari et al., 2003}; ^{Castiglioni et al., 2005}) 카 트리지를 사용하였고 드물게 C₁₈ 카트리지를 사용하기도 하 였다(^{Martinez-Villalba et al., 2009}).

^{Gros et al. (2006)}은 항생제를 포함한 29종의 의약물질에 대해 폴리머 흡착제를 사용하는 Oasis HLB와 Isolute ENV+ 카트리지, 비극성 카트리지인 C₁₈, 양이온 Oasis MCX 카트 리지를 적용하여 조건에 따른 추출 성능을 평가하였다. Oasis MCX카트리지는 산성 조건에서 모든 항생제에 대해 비교적 높은 회수율을 나타냈고 C₁₈ 카트리지도 다수의 항생제를 높은 회수율로 분리하는 것으로 나타났다. ENV+카트리지는 C₈이나 C₁₈에 흡착되지 않는 몇몇 극성이 강한 유기물질에 대해 매우 효과적인 것으로 보고되었으나 Oasis HLB가 다른 카트리지들에 비해 높은 회수율을 나타냈고, 넓은 범위의 pH 조건(pH 1~14)에서 효과적인 추출이 가능하다고 하였다. 이 외에도 다수의 연구에서 HLB 카트리지를 다양한 항생제 추출에 사용하여 높은 회수율을 나타낸 결과들을 보고하고 있다(^{Ben et al., 2008}; ^{Gros et al., 2013}; ^{Shelver et al., 2010}; ^{Zhou et al., 2012}). 특히, 테트라사이클린 계열의 항생제는 다가 금속이온과 결합하는 성질 뿐 아니라 실리카를 기본으 로 하는 흡착제에 존재하는 실라놀 작용기와 비가역적으로 결합하는 특성을 가지기 때문에 실라놀 작용기가 존재하지 않는 폴리머 재질의 Oasis HLB 카트리지를 사용할 때 높은 회수율을 나타내는 것으로 나타났다.

회수율을 향상시키기 위한 고상추출법의 한 방법으로 서 로 다른 성질을 갖는 두 종류의 카트리지를 직렬로 연결하 여 사용하는 방법이 사용되기도 하였다(^{Hong et al., 2015}; ^{Karthikeyan and Meyer, 2006}). 두 연구에서는 컨디셔닝 된 Oasis HLB와 MCX를 직렬로 연결하여 시료를 통과시키고 카트리지를 분리하여 각각 세척과 용리단계를 거쳐 용리된 시료를 혼합하여 최종 시료로 사용하였다. 이를 통해 보다 다양한 종류의 물질의 추출이 가능하며 분석 대상 물질들의 극성이 다양하게 분포되어 있는 경우 종종 활용되는 것으 로 나타났다. 유기물에 의한 오염이 심한 고체 시료를 대상 으로 한 ^{Zhou et al. (2012)}의 연구에서는 휴믹산(humic acid) 이나 펄빅산(fulvic acid)등을 제거할 목적으로 SAX와 HLB 를 직렬로 결합한 고상추출단계를 거치기도 하였다.

시료 적재를 통해 카트리지에 흡착된 분석대상물질은 메 탄올(methanol), 산성화 된 메탄올(acidified methanol), 아세 토니트릴(acetonitrile), 아세톤(acetone), 디클로로메테인(dichloromethane) 등으로 추출하고 질소농축 후 이동상 또는 적절 한 용매에 재용해 하여 액상 크로마토그래피에 도입된다. 일 부 항생제는 광분해성을 가지고 있기 때문에 시료들은 갈색 유리병에 넣어 어두운 곳에 보관한다.

일부 연구에서는 최종 전처리 단계에서 분리막으로 추출 액을 여과하기도 하는 것으로 나타났다(^{Martinez-Villalba et al., 2009}; ^{Nebot et al., 2012}; ^{Zhou et al., 2012}). ^{Nebot et al. (2012)}은 소 우유에 포함된 항콕시듐제(coccidiostats) 7종 을 분석하였는데 전처리 과정에서 최종 추출액을 0.45 μm PVDF 막으로 여과한 경우 HPLC-MS/MS 분석 신호의 강 도가 증가하고 회수율이 15%이상 향상됨을 보고하기도 하 였다. 그러나 주로 합성고분자를 재료로 하는 일부 분리막 은 유기용매에 의해 녹거나 분해되는 특성을 가지고 있으 며, 분석 대상 물질이 최종 여과 과정에서 분리막 및 여과 장치에 흡착되어 회수율이 감소하는 문제가 예상될 수 있기 때문에 여과에 사용될 분리막의 재료, 추출액의 용매 등을 고려하여 여과 단계의 적용성을 평가할 필요가 있을 것으로 사료된다.

조사 결과 아미노글리코사이드계열의 항생제인 겐타마이 신과 카나마이신을 물 시료에서 분석한 연구는 한 건이 조 사되었다(Table 5). 앞서 언급한 바와 같이 아미노글리코사 이드 계열의 항생제는 다수의 아미노기(-NH₂)와 수산화기 (-OH)를 가지고 있어 매우 높은 친수성을 나타내기 때문에 약한 양이온 교환 카트리지가 사용되었다. 또한 다른 항생제 들과 달리 중성 pH 조건(7.0~8.0)에서 전처리를 수행하였으 며 pH가 회수율에 미치는 영향은 평가하지 않았다(^{Loffler and Ternes, 2003}).

현재까지 물 시료를 대상으로 디히드로스트렙토마이신(dihydrostreptomycin), 네오마이신(neomycin), 스펙티노마이신 (spectinomycin), 스트렙토마이신, 아프라마이신(apramycin), 클로피돌(clopidol), 콜리스틴(colistin)을 LC-MS를 이용하여 분석방법을 개발하거나 분석 결과를 보고한 논문은 없는 것으로 파악되었다.

본 연구의 조사대상 항생제는 총 12개 이상의 계열로 분 류되며, 다양한 화학적 특성(극성, 친수성, 친유성, 용해도, pKa 등)을 가지고 있다. 다수의 연구를 살펴본 결과 전처 리 조건과 함께 분석 대상물질의 종류에 따라 상이한 전처 리 효율을 나타내고 있어 모든 항생제에 대해 적용 가능한 일반적인 전처리방법을 찾을 수는 없었다. 따라서 적절하고 효율적인 전처리 방법을 개발하고 적용하기 위해서는 대상 물질에 대한 화학적 특성과 전처리 과정의 메커니즘의 이해 를 바탕으로 분석대상물질에 따라 적절히 변형시킨 전처리 방법을 적용하도록 해야 할 것이다.

4. Pre-treatment Methods of Animal Originated Liquid Samples

2000년대 후반, 국제식량농업기구/세계보건기구 합동 식품 첨가물 전문가 위원회(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives: JECFA), 유럽연합, 중국, 일본 등 몇몇 나라들은 동물로부터 생산된 식품들에 대해 아미노글리코사 이드 계열 항생제의 최대잔류농도(maximum residue levels: MRLs) 기준을 발표했다. 이로 인해 동물의 간, 신장, 근육 등을 비롯해 우유, 꿀 등 액체식품을 대상으로 아미노글리 코사이드계열 항생제를 정확히 측정할 수 있는 방법에 대 한 연구가 진행되기 시작했다. Fig. 2, Table 6에 우유와, 꿀 등의 액체 식품을 대상으로 한 잔류항생제 측정방법과 회수 율을 정리하였다.

Fig. 2. Schematic diagram of typical procedures for pre-treatment of animal originated liquid samples.

꿀, 우유와 같은 시료는 단백질 등 높은 농도의 유기물을 함유하고 있고 시료중의 유기물질은 추출 효율을 감소시킬 뿐 아니라 분석과정에서 방해물질로 작용하게 된다. 따라서 우유나 꿀 시료의 경우 고상추출법 이전에 단백질 및 유기물 질을 제거하고 잔류항생물질을 추출하는 과정이 선행되어야 한다. 먼저 균질화를 거친 시료에 용매를 첨가하고 기계적인 혼합을 통해 잔류항생물질을 추출하고 원심분리를 통해 상 등액을 취한다. ^{van Bruijnsvoort et al. (2004)}은 꿀과 우유 시료에서 디히드로스트렙토마이신과 스트렙토마이신을 분석 하였는데 추출과정에서 헵테인설포닉산(heptanesulfonic acid) 을 사용하였으나 최근의 연구에서는 5% 트리클로로아세틱 산(trichloroacetic acid, TCA)을 주로 사용하는 것으로 나타 났다(^{Tao et al., 2012}; ^{Zhu et al., 2008}). 5% TCA는 꿀, 우 유뿐 아니라 동물의 근육, 신장, 간, 계란 등으로부터 아미 노글리코사이드계 항생제를 추출하기 위해 빈번히 사용되었 다(^{Kaufmann and Maden, 2005}; ^{Tao et al., 2012}; ^{Zhu et al., 2008}). ^{Kaufmann and Maden (2005)}은 13종의 아미노글리 코사이드계 항생제를 대상으로 TCA농도에 따른 회수율을 평가하였고 5%를 최적 농도로 제안하였다. 5% 이하의 TCA 농도에서는 회수율이 감소될 뿐 아니라 시료가 높은 탁도를 나타내는 것을 보고하였다.

추출 과정을 거친 시료는 고상추출법을 통해 정제과정을 거친다. 물 시료를 분석한 ^{Loffler and Ternes (2003)}의 연구 에서와 유사하게 시료의 pH를 7.5, 8.5로 조절한 후 고상추 출을 적용하였다. ^{Tao et al. (2012)}은 아미노글리코사이드 계 항생제의 화학적 특성을 고려하여 약한 양이온교환 카트 리지를 사용하였고 C₁₈, Oasis HLB 카트리지를 사용한 두 연 구에서도 비교적 높은 회수율을 얻었다. ^{Nebot et al. (2012)} 은 아세토니트릴로 추출한 우유 시료를 Strata^®-X와 메탄올 을 이용한 고상추출법을 적용하여 이오노포어계열의 잔류 항 생제를 검출하였고, ^{Wan et al. (2006)}은 염산으로 우유 시 료의 단백질을 제거하고 Strata^®-X와 포름산/메탄올/물 (0.2: 70:30, v/v/v) 혼합액으로 정제하여 colistin의 잔류량을 분석 하였다. 각 연구에서 보고한 회수율은 Table 6에 정리하였다.

5. Conclusions

본 연구에서는 국내에서 판매된 축산용 항생제의 판매량 을 조사하여 대상항목을 선정하고 액체시료에서 선정된 항 생물질을 LC-MS/MS로 분석하기 위한 전처리 방법을 조사 하였다. EPA 방법과 ^{Shin et al. (2012)}의해 제안된 방법을 우선적으로 검토한 결과 특정 계열의 항생제를 분석하기 위 한 전처리 방법으로 일부 유용하기는 하나 선정된 항생제를 모두 분석하는 것은 불가능한 것으로 나타났다. 따라서 액 체시료에서 선정된 항생물질을 모두 추출할 수 있는 전처리 방법을 도출하고자 하였다.

물 시료의 경우 고상추출법(solid-phase extraction)을 주로 사용하며 pH조절-카트리지 컨디셔닝-시료적재-추출-농축 및 재용해 등의 단계를 거처 원하는 물질을 추출하고 농축하 였다. 아미노글리코사이드계 항생제를 제외한 나머지 항생 제는 산성조건(2.5~4.0)에서 고상추출을 수행하며 산성 조건 에서 이온 형태로 존재하는 금속은 특정 계열의 항생제와 결합하여 회수율을 감소시키므로 이를 막기 위하여 전처리 과정에서 EDTA를 첨가하여 금속이온과의 킬레이트 결합을 유도하는 것으로 나타났다. 일부 페니실린계 항생제의 경우 산성조건에서 분해되는 특성 때문에 중성조건으로 추출 시 향상된 회수율을 나타내는 것으로 보고되고 있으나, pH 조 절 후 짧은 시간 내에 고상추출과정을 완료하는 경우 만족 스러운 회수율을 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 용리액으 로 메탄올이 가장 많이 사용되었으며 아세톤, 아세토나이트 릴 또는 디클로로메탄을 혼합한 용매를 사용한 연구도 보고 되고 있다. 카트리지는 Strata^®-X, Oasis HLB, MCX 등이 주로 사용되었으나, 산성 시료에서는 HLB 카트리지에서 가 장 높은 회수율을 나타내는 것으로 보고하고 있다. 특히 실 라놀 작용기와 결합하는 특성을 가진 항생제를 추출하기 위 해서는 HLB 카트리지의 사용이 필수적이었다. 물 시료에서 아미노글리코사이드계 항생제와, 클로피돌, 콜리스틴을 분석 한 결과를 보고한 문헌은 없는 것으로 조사되었다.

우유와 꿀 시료의 잔류항생제를 분석하기 위해서는 고상 추출법 이외에 추가적인 전처리가 필요하며 균질화 후 추출 용액을 기계적 교반 등의 방법으로 접촉/혼합하는 과정을 거친다. 원심분리기를 이용하여 고형물을 제거하고 고상추 출법으로 대상물질을 농축 및 정제하여 HPLC로 분석한다. 5% 트리클로로아세트산이 시료 중의 단백질을 제거하고 아 미노글리코사이드계 항생제를 추출하는데 주로 사용되고, 물 시료와 동일하게 중성(7.5, 8.5)조건으로 pH를 조절한 후 카 트리지에 적재한다. 우유 시료에서 콜리스틴과 이오노포어계 열의 항생제를 분석한 논문은 각각 한 건씩 보고된 것으로 조사되었다.

잔류 항생제에 대한 관심이 낮고 관심 물질의 종류가 적 었던 과거에는 분석 및 전처리 방법이 물리화학적 성질이 유사한 계열별로 발전되어 왔다. 그러나 항생제의 사용량 및 종류가 증가하고 환경 중 잔류항생제의 영향에 대한 관심이 커지면서 다양한 계열의 항생제를 동시에 추출·농축 할 수 있는 전처리 방법들이 보고되고 있다. 그럼에도 불구하고 극 성, 용해도, 친수성, pKa 등의 화학적 특성의 차이로 인해 일 부 페니실린계, 아미노글리코사이드계 항생제는 타 계열 항 생제들과 상이한 전처리 과정이 필요한 것으로 조사되었다. 현재까지 어떠한 국가나 공인된 기관에서도 잔류항생제 분 석을 위한 표준 방법을 제안하고 있지 않으며, 2007년 EPA 에서 액체, 고체 시료에 대한 의약물질 분석방법을 제안한 EPA method 1694를 발간하였지만 아미노글리코사이드계 열의 항생제에 대해서는 언급하지 않고 있다.

결론적으로, 액상 시료중의 항생제 오염 실태를 파악하기 위해서는 정확하고 검증된 분석방법의 개발 및 공정시험법 의 수립이 선행되어야 하며, 본 연구에서 선정한 37종의 항 생제를 분석하기 위해서는 최소 2가지 이상의 전처리 과정 이 개발되어야 할 것으로 판단된다.