1. Introduction

다양한 의약품 및 개인위생용품(Pharmaceuticals and personal care products, PPCPs) 사용 등 의학의 발달로 인한 인간수명의 연장 및 이로 인한 세계 인구의 증가(Fig. 1)는 또 하나의 환경 문제의 원인이 되고 있다. 특히 PPCPs를 대표하는 의약물질은 인간과 동물의 질병 치료와 예방을 목적으로 사용되는데 섭취 한 그대로 또는 일부 변형된 대사산물(metabolite)의 형태로 배 출되어 지표수 등 환경에서 μg/L 수준으로 검출되고 있다 (^{Seifrtova et al., 2009}).

Fig. 1. Projection of population of the world (1950-2015: estimates; 2015~2100: medium-variant projection and 80 and 85 percent confidence intervals) (United Nations (2015)).

환경 시료 중에 존재하는 미량 농도의 잔류항생제의 분석은 액체크로마토그래피(liquid chromatography, LC)를 이용한 물 질 분리와 UV, 형광도 또는 질량분석기(mass spectrometry)를 이용한 검출 기법을 사용한다. 과거에는 분석대상 항생제가 갖는 고유의 특성에 따라 photodiode array(PDA) 검출기나 형 광검출기(fluorescence detector: FLD)를 이용하였으나 다 계열 의 항생제를 동시에 분석하려는 시도들이 늘어남에 따라 최근 의 연구들은 MS/MS를 이용한 항생제 검출 방법이 주로 사용 되고 있다(^{Boscher et al., 2010}; ^{Gorissen et al., 2015}; ^{Gros et al., 2013}; ^{Hou et al., 2015}; ^{Tao et al., 2012}).

다양한 종류의 PPCPs 중 항생제는 인간의 보건에 심각 한 문제를 야기할 수 있기 때문에 많은 관심과 함께 다양 한 연구가 진행되고 있다. 항생제는 인간의 질병치료 뿐 아니라 축산업의 생산성을 높이기 위한 목적으로 널리 사 용되어 왔으며 항생제 오·남용으로 인한 항생제 내성 박테 리아의 문제는 1990년대부터 보고되기 시작하였다(^{Bonnet, 2004}; ^{Hur et al., 2012}; ^{Neu, 1992}; ^{Pfeifer et al., 2010}). 항생제는 다양한 경로로 환경에 유입되는데 인간의 활동에 의해 유입되는 항생제는 대부분의 경우 하수처리장을 거치 고 있으나 일부 항생제들은 제거 효율이 낮고(^{Behera et al., 2011}) 항생제 수거 및 처리 등에 관한 적절한 규제가 없어 방류수를 통해 지표수, 즉 환경으로 유입된다. 가축용 항생제의 경우 주로 배설물을 통해 배출되는데 일부 대규 모의 사육시설을 제외한 중소규모의 농가들은 적절한 축산 분뇨처리 시설 없이 퇴비화를 통해 배설물을 처리해 오고 있다. 그러나 모넨신(monensin), 설파메타진(sulfamethazine), 록시트로마이신(roxithromycin), 티아물린(tiamulin) 등과 같 은 물질들은 퇴비화 과정에서 제거되기 어려운 것으로 보 고되고 있고(^{Dolliver et al., 2008}; ^{Schlusener et al., 2006}) 퇴비의 형태로 자연 중에 살포되는 것으로 나타났다. 비료 를 통해 환경으로 유입된 항생제는 토양에 흡착되거나 빗 물과 함께 주변 유역, 지하수로 흘러들어 오염을 야기하며 잠재적으로는 항생제 저항 유전자를 생성하는 원인 물질로 작용할 수 있다(^{Martinez-Carballo et al., 2007}; ^{McArdell et al., 2003}; ^{Tolls, 2001}). 테트라사이클린계열(tetracyclines)의 항생제는 양이온들과 결합하여 착물을 형성하는 특성을 가 지고 있어 토양에 높은 농도로 흡착되는 것으로 알려져 있 고(^{Avisar et al., 2010}; ^{Kim et al., 2012}), 베타-락탐계열(β -lactams)이나 설폰아마이드계열의 항생제는 비교적 물에 잘 녹는 특성으로 인해 빗물과 함께 수환경으로 쉽게 확산 되는 특징을 나타낸다(^{Avisar et al., 2010}; ^{Kim et al., 2012}; ^{Li et al., 2010}). 특히, 우리나라의 가축용 항생제 판매량은 사료 혼합 금지와 처방전 사용을 필수화 하는 등의 규제에 의해 점차 감소하는 경향을 보이고 있으나, 여전히 세계적 으로 큰 가축용 항생제 시장을 보유하고 있는 국가 중 하 나이다(^{Lim et al., 2014}). 특히 항생제의 사용량과 내성 박 테리아 사이에 확실한 양적 상관관계는 다수의 연구를 통 해 밝혀진 바 있어(^{Bronzwear et al., 2002}; ^{Goossens et al., 2005}) 우리나라 환경의 항생제 오염에 대한 실태 파악과 대안 마련을 위한 연구가 필요한 상황이다.

항생제 및 의약물질로 인해 발생하는 이처럼 다양하고 복 잡한 환경오염 실태와 인간 영향에 대한 모니터링을 위해, 1999년부터 2000년까지 미국 지질조사소(U. S. Geological Survey, USGS)는 30개주, 139개 하천수를 채취하고 95종의 의약품, 호르몬 등의 잔류 실태를 조사하면서 의약물질의 관 리와 규제의 필요성을 주장하였고 수환경에서의 거동과 인간 건강에 미치는 영향을 이해하기 위해 대사물질의 모니터링이 중요하다고 하였다(^{Kolpin et al., 2002}). 이를 토대로 2007년 에는 미국의 수질오염방지법(Clean Water Act)에 사용할 목 적으로 HPLC-MS/MS 기술을 통해 PPCPs를 분석할 수 있는 EPA method 1694 (^{U. S. EPA, 2007})를 발표하여 PPCPs 관 리 체계를 구축해 오고 있다. 2013년, 미국 질병통제예방센터 (United States Centers for Disease Control and Prevention, U. S. CDC)에서는 항생물질 내성(antibiotic resistance)의 위험성 과 심각성을 설명하고 즉각적인 조치들의 필요성을 알리기 위한 목적으로 보고서를 발간하였으며 베타-락탐계, 설폰아 마이드계, 플로로퀴놀론계 항생제에 대한 내성이 매우 흔하 게 관찰된다고 보고하고 있다(^{CDC, 2013}). 특히 항생제 내성균 모니터링을 위해 NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring System)을 마련하고 인간과 동물, 식품을 구분하 여 항생제 내성균에 대한 모니터링을 수행해오고 있다. NARMS는 항생제 내성 박테리아를 추적하는 보건 감시 시스 템으로 US CDC, 미국 식품의약국(United States Food and Drug Administration, US FDA), 미국 농무부(United States Department of Agriculture, USDA)와 각 주의 위생국이 참여 하는 관계부처 협력 사업이다(^{CDC, 2015}). 인간에게 감염을 일으키는 항생제 내성 장내세균에 대한 감시 시스템은 1996 년 14개 지점으로부터 시작되었고 2003년부터는 미국 전역을 대상으로 모니터링을 수행 해 오고 있다(^{CDC, 2015}). FDA 에서는 인간이 노출될 수 있는 직접적인 경로 역할을 하는 시 장에 판매되는 육류를 대상으로 박테리아의 저항성에 관한 정보를 제공한다(^{FDA, 2015}). USDA는 CDC와 FDA의 모니터 링 결과 및 자체 조사를 통해 음식을 매개로 하는 병원균과 박 테리아를 조사하고 항생제 내성균의 발생 및 전파 특성이나 패 턴 등을 연구한다(^{USDA, 2016}). 각 기관들은 1년에 1회 이상, 주기적으로 보고서를 발간하며 홈페이지를 통해 공개하고 있는 것으로 조사되었다(^{CDC, 2015}; ^{FDA, 2015}; ^{USDA, 2016}).

우리나라는 국립환경과학원을 중심으로 2006년부터 환경 중 의약물질 분석방법 및 실태조사, 환경 위해성 평가, 배출 원 및 거동 연구, 대사 및 분해조사, 항생제의 내성률 등을 조사하고 이를 관리하기 위한 연구를 지속적으로 수행해 오 고 있고 있으며 2003년부터 농림수산검역검사본부에서 ‘축 산용 항생제 관리 시스템 구축 사업’을, 2008년부터는 농림 수산식품부가 주관하여 ‘축산 항생제 내성균 감시체계 구축’ 사업을 실시하였다. 이러한 다양한 연구 결과를 토대로, 환 경부에서는 가축 사육 과정에서 발생되는 잔류 항생물질에 의한 환경오염과 피해의 심각성을 인식하고 ｢가축분뇨의 관 리 및 이용에 관한 법률｣과 ｢가축분뇨실태조사의 세부 절차 및 방법 등에 관한 고시｣를 제정·발표하였다(^{Korea Ministry of Government Legislation, 2015}).

이러한 노력에도 불구하고 잔류항생물질을 분석하기 위한 국내 표준시험방법이 정립되어 있지 않고, 국립환경과학원에 서 발표한 연구 보고서에서는 분석방법을 개발하여 보고한 문헌들을 기본으로 하여 개량, 수정한 분석방법을 적용하고 있으나 의약물질을 계열에 따라 5 개의 그룹으로 구별하여 전처리 및 분석조건을 다르게 적용하고 있어 인력과 시간의 소모가 큰 문제를 가지고 있다.

정확하고 효율적인 실태조사와 오염 관리를 위해서는 분석 인력 및 시간을 최소화할 수 있는 검증된 분석방법의 개발과 적용을 통한 신뢰성 있는 데이터의 확보가 매우 중요하다. 본 연구에서는 선정된 37종의 동물용 항생제 중 U. S. EPA method 1694(^{U. S. EPA, 2007}) 대상 16종의 항생제를 중심 으로 1) LC-MS를 사용한 분석방법 및 조건을 조사하고 2) 방법의 유효성을 평가하여 EPA 분석법의 검출성능과 비교 하였다. 이를 토대로 향후 표준화된 항생제 분석 방법 수립 을 위한 기틀을 마련하고자 하였다.

2. Material and Methods

본 연구에서는 LC-MS를 활용하여 동물용 항생제를 분석 한 문헌을 조사하고 기기분석 방법 및 항생제 계열별 분석 특성을 평가하고자 하였다. 한 계열 이상의 항생제들을 분 석한 문헌을 조사 대상으로 하였고 의약물질의 분석방법을 제시한 미국 EPA method 1694가 발표된 2007년 이후에 보고된 문헌들을 위주로 검토하였다.

3. EPA method 1694

미국 EPA에서는 환경 시료 중의 의약물질과 개인위생용품 (pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)을 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)와 텐덤 질량분석기를 이용해 분석하는 방법을 개발 하였고 액체, 고체, 바이오 고체로 구분하여 적용할 수 있는 방법을 보고하고 있으며(U. S. EPA, 2007) 기존의 EPA method(^{U. S. EPA, 1984}; ¹⁹⁹⁶; ²⁰¹⁰)들과 AXYS Analytical Services에서 개발된 방법, 기존의 연구들(^{Castiglioni et al., 2005}; ^{Fiese and Steffen, 1990}; ^{Hirsch et al., 1998}; ^{Kolpin et al., 2002}; ^{Lindsey et al., 2001})을 토대로 하고 있다. 기존 문 헌에 보고된 일반적인 분석방법을 수정하여 전처리 조건과 (pH 2.0 또는 pH 10.0) 텐덤 질량분석기의 이온화 조건((+) 이온화 또는 (-)이온화) 등에 따라 4개의 그룹을 설정하고, 64종의 대상 PPCPs 물질을 포함시키는 방법으로 그룹을 구 성하였다. 대부분의 항생제는 그룹 1과 2에 포함되어 있는데 베타-락탐계, 플로로퀴놀론계, 린코사미드계, 매크로라이드 계, 설폰아마이드계 등의 항생제는 그룹 1에, 테트라사이클 린계열의 항생제가 그룹 2로 분류된다. 그룹 1, 2는 산성조 건(pH 2)에서 고상추출이 이루어지고 positive 이온화 방식 을 사용하는 특징을 보이고 있는데 총설 I, II에 통해 가축용 항생제 분석을 위한 자세한 전처리 방법들을 EPA method 1694와 함께 고찰하여 보고하였다. 또한, 물질에 따른 방법 검출한계와 최소정량수준을 제시하고 있으며 검정농도의 범 위와 시료상(phase)에 따른 회수율도 보고하고 있다. 분석방 법의 검증을 위한 검출 한계와 회수율 등은 다음 절에서 보 다 자세히 검토하고 다양한 문헌에 보고된 값들과 비교하고 자 하였다.

4. Chromatographic Separation Methods

Table 2는 동물용 항생제 분석을 위한 LC 조건을 정리하 여 나타내었다. HPLC 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 (ultra performance liquid chromatography, UPLC)를 적용하 는 것으로 확인되었다. UPLC는 2 μm 이하의 입자 크기를 갖는 고정상으로 제작된 컬럼을 적용하고 HPLC 보다 높은 압력으로 분리를 수행한다. 작은 입자를 사용함에 따라 고정 상과 이동상이 접촉할 수 있는 표면적이 증가하여 컬럼 길이 를 줄일 수 있고, 높은 압력으로 분리를 수행함에 따라 빠른 유속의 적용이 가능하다. 이러한 특징을 통해 UPLC에서 HPLC 보다 짧은 분리시간, 높은 민감도와 재현성의 구현이 가능하게 되었다. 실제로 조사된 문헌에 따르면 HPLC에서 는 이동상의 유량이 0.1~0.35 ml/min범위로 나타났으나 UPLC에서는 0.25~0.45 ml/min유량으로 이동상이 주입되는 것으로 조사되었다.

Table 2. Comparison of detection methods and chromatographic conditions for the 16 selected antibiotics (FA: formic acid; ACN: acetonitrile; RRLC: rapid resolution liquid chromatography; UPLC: ultra performance chromatography; AF: ammonium formate; MeOH: methanol; HFBA: heptafluorobutyric acid)

컬럼은 EPA 방법을 포함하여 대부분의 문헌에서 역상 C₁₈ 컬럼을 사용하였고 일부 연구에서는(^{Iglesias et al., 2012}; ^{Nebot et al., 2012}) phenyl을 작용기로 하는 고정상을 충진한 Synergi Polar RP 컬럼을 사용한 것으로 나타났다. 일반적으로 phenyl 컬럼은 방향족 아민, 극성이 강하고 물에 잘 녹는 물질 을 분리하는데 향상된 성능을 나타낸다. C₁₈ 컬럼에서 나타나 는 극성결합 외에 파이결합(π-π interaction)이 물질 분리 메커 니즘으로 작용하기 때문에 상대적으로 넓은 선택성을 갖는다. 항생제 연구에 있어서는 일부 극성을 나타내는 테트라사이클 린계, 설폰아마이드계, 퀴놀론계 등을 분석하는데 사용될 수 있으며 ^{Iglesias et al. (2012)}와 ^{Nebot et al (2012)}의 연구에서 도 설폰아마이드계열, 퀴놀론계열(quinolones) 항생제 등의 잔 류농도 분석방법을 개발하고 적용한 결과를 보고하고 있다.

컬럼의 온도는 이동상과 고정상, 분리 물질 간의 화학적 인 상호작용에 영향을 미치기 때문에 컬럼 온도가 일정하 게 유지되지 않는 경우 머무름 시간(retention time, RT)이 변하거나 선택성의 차이로 인해 용리 순서(elution order)가 변할 수 있다. 특히 컬럼 내부에서 위치에 따른 온도차이 가 발생할 경우 피크(peak) 모양의 왜곡이 발생할 수 있어 컬럼 오븐을 사용하여 일정 시간 이상 예열을 거친 후 분 석을 진행한다. 개발된 분석방법들이 제시하는 설정 온도의 범위는 15~45°C로 나타났으나 대부분은 30~40°C 조건을 적용하고 있다. EPA method는 40°C로 컬럼 온도를 제시하 고 있다.

항생제를 LC로 분리하는데 사용되는 이동상으로는 극성 용매인 물과 비극성용매를 기본으로 사용한다. 비극성 용매 로는 아세토나이트릴(acetonitrile)이 가장 많이 사용되는 것 으로 조사되었으며 메탄올(methanol) 또는 메탄올과 아세토 나이트릴의 혼합액이 유사한 빈도로 적용되는 것으로 나타 났다. 모든 연구에서 극성용매와 비극성용매의 혼합비율을 시간에 따라 달리하는 구배용출법(gradient elution)을 사용 하고 있으며 높은 비율의 물과 함께 컬럼에 도입되어 고정 상에 고정된 분석물질들은 이동상 중에 비극성 용매의 비 율이 높아짐에 따라 순차적으로 고정상에서 용리되어 컬럼 외부로 유출된다. 모든 물질은 고유한 특성으로 서로 다른 극성도를 가지고 있으며 이로 인해 특정한 머무름 시간을 갖는다. 이동상에서 비극성 용매의 비율을 빠르게 증가시키 면 물질의 고정상에 머무르는 비극성 물질의 분리가 용리 속도가 증가하여 빠른 시간에 크로마토그래피를 완료할 수 있으나 검출기에서 검출되는 물질 각각의 피크가 중첩되는 문제를 야기할 수 있다. 메탄올과 아세토나이트릴 용매의 경우 서로 비극성도에 차이를 가지고 있어 극성이 낮은 메 탄올에서 보다 빠른 용출이 진행되며 메탄올과 아세토나이 트릴 혼합 용매를 사용하는 경우 이를 토대로 혼합 비율이 결정된다.

이동상에는 포름산(formic acid), 옥살산(oxalic acid), 포름 산암모늄(ammonium formate), 초산암모늄(ammonium acetate) 등을 첨가하는데 휘발성 첨가제를 사용함으로써 항생제의 이온화 효율이 증가하고 질량분석기에서 감도(sensitivity)가 향상되는 것으로 보고되고 있다(^{Seifrtova et al., 2009)}. ^{Yang et al. (2010)}의 연구를 제외한 모든 연구에서 0.05~0.3%의 포름산을 첨가물로 사용하는 것으로 나타났고 일부 문헌에 서는 포름산과 함께 포름산암모늄(^{Ho et al., 2012}, ²⁰¹⁴; ^{Li et al., 2012}; ^{U. S. EPA, 2007})이나 초산암모늄(^{Zhou et al., 2012}; ^{Zhou et al., 2013})을 첨가하기도 하였다. 일반적으로 HPLC-MS 이동상에 첨가하는 첨가제는 휘발성이 강한 물질 을 주로 사용하고 옥살산은 상대적으로 낮은 휘발성 때문에 거의 사용되지 않았다. 그러나 ^{Yang et al. (2010)}은 0.1%의 포름산과 5 mM의 옥살산을 pH 조절용 첨가제로 사용하고 각각의 MS 스펙트럼을 비교한 결과 포름산을 사용한 경우 에 테트라사이클린계열의 항생제 피크에서 심각한 테일링 (tailing) 현상이 나타남을 확인하였다. 옥살산으로 pH를 조 절한 결과 테일링 현상이 나타나지 않았으며 이는 옥살산이 메탈 이온과 결합하는 강한 킬레이트제로 작용하여(^{Kartal, 2003}) 테트라사이클린계열의 항생제와 메탈이온의 결합으로 인한 피크의 왜곡을 방지한다고 하였다. EPA method 1694 에서도 테트라사이클린계열의 항생제와 그 대사물질들은 다 른 계열의 항생제 분석방법과 동일한 전처리 과정을 거치나 그룹 2로 따로 분류하여 옥살산을 첨가제로 사용하는 기기 분석 조건을 적용하고 있는데 ^{Yang et al. (2010)}이 언급한 것과 동일한 이유일 것이라 판단된다.

^{Zhou et al. (2012)}은 5 mM 옥살산, 0.1% 포름산, 0.5% 포 름산, 0.1% 포름산(+5 mM 초산암모늄), 0.1% 포름산(+2 mM 초산암모늄), 0.2% 포름산(+2 mM 초산암모늄)을 이동상으로 사용하여 분석 효율을 평가하였다. ^{Yang et al. (2012)}의 연구 와 동일하게 옥살산을 사용한 경우 테트라사이클린계열의 항 생제에 있어서 더 높은 감도, 분해능(resolution), 반복성 (repeatability)과 낮은 매트릭스 효과(matrix effect)를 나타내 었으나 옥살산은 휘발성이 낮기 때문에 LC-MS/MS 기기의 모세관 경계(capillary interface)에 축적되는 문제가 발생할 수 있다고 하였다. 반면 0.2% 포름산(+2 mM 초산암모늄)을 이 동상으로 사용하였을 때 테트라사이클린계열의 항생제에 대 해서도 충분한 감도를 나타냄과 동시에 플로로퀴놀론, 이오 노포어(ionophore), 매크로라이드계열의 항생제에서는 다른 조건에서 보다 높은 피크 분해능과 감도를 나타내는 것을 보 고하기도 하였다.

^{Gbylik-Sikorska et al. (2015)}는 헵타플로로부티르산(hept-fluorobutyric acid)을 첨가하였는데 이는 이온쌍 크로마토그래 피(ion-pair chromatography)를 적용할 때 이온 쌍 시약(ion pair reagent)으로 사용하는 일반적인 물질이다. ^{Gbylik-Sikorska et al. (2015)}는 극성을 띄는 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계 열의 항생제(^{Karthikeyan and Meyer, 2006}) 4종을 포함하여 9개 계열의 항생제를 동시에 분석하는 분석법을 개발하였고 이를 위해 이온쌍 크로마토그래피를 사용, 총 13분의 분석시간 동안 45종의 항생제를 분리·분석하였다고 보고하고 있다.

5. Mass Spectrometric Detection Methods

HPLC 또는 UPLC에 의해 분리된 항생제는 이온화단계를 거치고 질량분석기를 통과하면서 질량에 따라 분리되어 검 출기에서 검출된다. 항생제 분석방법을 조사한 결과 모든 연 구에서 전자분무이온화(electrospray ionization: ESI)법을 사 용하는 것으로 나타났다. 일반적으로 이온화 장치를 거친 분 자들은 이온화 방식(positive 또는 negative)에 따라서 양자를 얻거나 잃어서 [M+H]⁺ 또는 [M-H]^- 형태의 분자로 이온화되 며 모넨신, 살리노마이신 등과 같은 항생제는 나트륨 염 [M+Na]⁺의 형태로 이온화 되기도 한다(^{Zhou et al., 2012}). 본 연구에서 선정한 16종의 항생제는 모두 positive 방식의 이온화가 적용되고 있으며 [M+H]⁺의 형태의 전구체를 형성 하는 것으로 조사되었다(Table 3). ^{Boscher et al. (2010)}는 유일하게 페니실린G(penicillin G) 분석을 목적으로 negative 방식의 이온화를 적용한 것으로 보고하였다. 13개 계열, 33 종의 동물용 항생제를 LC-MS/MS로 분석하는 방법을 개발 하면서 페니실린 계열과 페니콜계열(phenicols)의 일부 항생 제들은 negative 방식의 이온화를 적용하였으나 이에 대한 효과나 목적에 대해서는 언급하지 않고 있다.

Table 3. Comparison of mass spectrometric conditions for detection of the 16 selected antibiotics

항생제를 분석한 모든 문헌은 MS/MS 또는 MS/Orbitrap의 형태로 구성된 텐덤 질량분석기를 적용하고 있으며 두 개 이 상의 질량분석기를 사용할 때 적용 가능한 방법인 선택반응 검출(selected reaction monitoring, SRM) 방식으로 대상물질 을 정성·정량한다. 선택반응검출 방식에서 이온화된 전구체 중 특정한 질량 대 전하 비(m/z)를 갖는 이온들이 첫 번째 질 량 분석기에 의해 분리되고 충돌 셀(collision cell)에서 충돌 에너지(collision energy, CE)와 가스(collision gas)에 의해 쪼 개진다. 쪼개진 입자들(fragments)은 사중극자(quadrupole) 또는 orbitrap(ion trap mass analyzer)으로 이동하고 특정한 질량 대 전하 비를 갖는 물질이 분리되어 검출기로 보내진 다. 일반적으로 시료 중 분석대상 물질의 양을 측정하고 (quantification) 물질의 종을 검증(confirmation)할 목적으로 강한 검출신호를 갖는 두 종류의 전이체(transitions)를 선정 하고 해당 질량 대 전하 비를 갖는 물질을 검출한다. 분석하 고자 하는 대상 물질이 정해진 경우 SRM 방식을 적용하면 빠른 시간에 정확한 스크리닝(screening)이 가능하여 규칙적 이고 지속적인 시료 분석을 필요로 하는 경우 매우 유용한 방법으로 사용되고 있다.

5.2. 설폰아마이드계와 트라이메소프림

설폰아마이드계열은 인의용, 축산용을 구분하지 않고 가장 많이 연구되어온 항생제이다. 특히, 인의용으로 사용되는 설파 메톡사졸(sulfamethoxazole)은 트라이메소프림과 일정한 비율 로 혼합된 형태로 제품화되는 경우가 많아 설폰아마이드계열 의 항생제만큼 빈번하게 트라이메소프림에 관한 연구가 보고 되고 있다(^{Seifrtova et al., 2009}). 축산용 설폰아마이드계열의 항생제로는 설파클로로피리다진(sulfachloropyridazine), 설파 티아졸(sulfathiazole), 설파메타진, 설파디아진(sulfadiazine) 등 이 분석방법을 개발하는 문헌에서 자주 다루어진다. 설폰아마 이드계열의 물질들은 형광성을 갖고 있지 않기 때문에 형광광 도계를 사용한 검출이 불가능한 반변 260 nm(^{Li et al., 2007}) 또는 272 nm(^{Malintan and Mohd, 2006}) 파장의 빛을 흡수하는 특성으로 인해 HPLC-UV를 이용해 농도를 측정하기도 하였다. 그러나 MS에 비해 감도가 낮고, 환경시료의 경우 다양한 방해 물질이 존재할 수 있기 때문에 그 사용이 매우 제한적이다.

설폰아마이드계열의 항생제는 이온화 과정에서 positive 또 는 negative 방식 모두 적용이 가능한 것으로 보고되고 있으 나(^{Hao et al., 2006}) 대부분의 경우 positive 방식을 사용하고 [M+H]⁺ 형태로 이온화가 진행된다. 전이체로 관찰되는 쪼개 진 입자들은 m/z = 92([M-RNH₂-SO₂]⁺), 108([M-RNH₂-SO]⁺), 154([M-RNH₂]⁺)를 갖는 이온들이 주를 이루고 있으며 대부 분의 설폰아마이드계열의 항생제는 m/z = 156의 이온을 정 량이온으로 사용하는 것으로 나타났다. Fig. 2에서 분자량 255 를 갖는 설파티아졸에 대한 전이체와 텐덤질량분석 스펙트 럼(tandem mass spectrum)의 예를 보여준다.

Fig. 2. Tandem mass spectrum of sulfathiazole and collisioninduced dissociation mass fragmentation (Hao et al. (2006))

6. Method Validation

본 연구에서는 개발된 분석 방법의 유효성을 평가하기 위해 제시된 검정선의 범위와 선형성, 회수율, 방법검출한 계, 방법정량한계를 조사하였고(Table 4), EPA method 1694(^{U.S. EPA, 2007})에서 제시한 회수율과 검출한계를 비 교하여 개발된 방법들의 특성을 확인하고자 하였다. 검정곡 선의 범위는 0부터 수백~수십만 μg/L(또는 μg/kg)까지 적 용된 것으로 나타났다. 이는 대상 시료의 종류에 따라 다 른데 상대적으로 예상되는 농도가 낮은 지표수를 시료로 하는 경우 1 μg/L 이하의 농도에서 검량선을 작성하기도 하고(^{Iglesias et al., 2012}; ^{Pozo et al., 2006}) 높은 잔류량 이 예상되는 가축 배설물(excreta)이나 퇴비(manure)를 대상 으로 하는 경우에는 5,000 μg/kg(^{Gorissen et al., 2015}; ^{Jacobsen and Halling-Sorensen, 2006}) 또는 100,000 μg /kg(^{Hou et al., 2015}) 까지 검량선을 작성하는 것으로 나타 났다. 직선성을 나타내는 r² 값은 ^{Lopes et al. (2012)}와 ^{Dasenaki and Thomaidis (2010)}의 연구(r²>0.98)를 제외한 모든 연구에서 0.990 이상의 값을 갖는 것으로 나타났다.

Table 4. Comparison of analytical method validations for the selected antibiotics according to original sample matrixes (AFW: animal feeding water; SW: surface water; WWI: wastewater influent; WWE: wastewater effluent; SWW: swine wastewater; GW: ground water; MBF: meat-based baby food; PMIF: powdered milk-based infant formula)

EPA method 1694는 시료의 상에 따라 회수율을 제시하였 고 17.1~214.04% 범위를 갖는 것으로 나타났다. 페니실린 G, 린코마이신, 타이로신 등이 상대적으로 높거나 낮은 회수율 을 나타내고 있으며 플로로퀴놀론계열, 설폰아마이드계열, 테 트라사이클린계열의 항생제들은 59.1~158.5%(평균 101.4%) 로 유효한 범위의 회수율을 나타내고 있다. 특히 린코마이신 의 경우 물, 고체, 바이오고체의 회수율을 각각 17.1, 55.95, 198.99%로 보고하고 있는데 이는 다른 문헌에서 보고하는 63~137%에 비해 매우 낮은 값이다. LC-MS/MS분석 방법에 서는 시료의 전처리 효율이 회수율을 결정하는 주요한 인자 로 작용하며 상대적으로 매질이 깨끗한 물 시료에서 높은 회 수율을 나타낼 것이라 예상되나 전처리 조건에 따라 고체 시 료에서 높은 회수율을 나타내는 경우도 다수 보고되고 있다 (Table 4). 이는 다양한 항생제의 화학적 특성에 기인한 것으 로 조사된 문헌이 다 계열의 항생제를 대상으로 하는 전처리 방법을 개발하고 있고 모든 물질에 최적화된 전처리 방법을 도출하기 어렵기 때문이다. 따라서 다양한 화학적 특성을 갖 는 다 계열의 항생제를 대상으로 하는 분석법의 개발을 위해 서는 충분한 회수율을 얻을 수 있는 대상물질의 범위를 결정 하는 것이 매우 중요할 것이다.

분석방법의 감도를 평가하기 위해서 MDL과 MQL을 측 정하여 제시한다. MDL과 MQL은 일반적으로 신호 대 잡 음비(signal-to-noise ratio: S/N)를 계산하여 결정하며 3이 되는 농도를 검출한계(limit of detection, LOD), 10이 되는 농도를 정량한계(limit of quantification, LOQ)로 나타낸다. EPA method는 물 시료의 MDL을 0.1~13 ng/L로, 고체 시 료의 MDL을 0.55~13 μg/kg으로 제시하고 있어 각각 ppt수 준, ppb수준 까지 검출이 가능한 것으로 나타났다. 조사된 문헌들에서도 물 시료는 ppt수준 까지, 고체 시료는 ppb 수 준 까지 잔류 항생제를 검출할 수 있는 것으로 나타나 환 경시료 중에 미량으로 존재하는 잔류 항생제를 검출하는데 적용이 가능한 방법이라 할 수 있다.

결정한계와 탐지역량은 유럽연합에서 도입한 것으로(^{EU Commission, 2002}) 사람이 먹는 식·가공품에 잔류하는 항생 제를 측정하는 분석방법을 검증하기 위한 기준 중 하나로 사 용된다. 일반적으로 최대잔류기준(maximum residue limit: MRL)이 도입된 항생제에 대한 분석방법의 검증기준으로 사 용되는데 아미노글리코사이드계열의 항생제에 대한 분석방 법을 제시한 대부분의 문헌에서 사용하는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서 검토한 문헌 중 ^{Bohm et al. (2012)}, ^{Freitas et al. (2014)}, ^{Nebot et al. (2012)}은 결정한계와 탐지 역량을 계산하여 보고하였는데, 언급된 연구들은 유럽에서 진행되었고 꿀, 소고기, 우유를 시료로 사용하고 있어 EU에 서 설정한 MRL이 존재하기 때문인 것으로 판단된다.

7. Conclusions

본 연구는 선행 연구를 통해 선정된 36종의 동물용 항생 제 중 미국 EPA method 1694 대상 16종의 항생제를 선정 하여 해당 물질의 잔류 농도를 측정하기 위한 분석 방법을 고찰하였다. 특정 항생제 계열이 갖는 특징에 따라 HPLC 를 통해 분리된 물질을 형광광도계나 UV spectrometer를 이용하여 측정하는 방법을 사용하기도 하였으나 최근에는 미량 농도의 측정과 다 계열의 항생제를 동시에 측정할 수 있는 방법이 개발되어 HPLC와 텐덤 질량분석기(MS/MS)를 활용한 기술들이 적용되고 있다.

LC 단계에서는 HPLC 또는 UPLC를 사용하며 대부분의 경우 역상 C18컬럼을 사용하며 30~40°C로 컬럼 오븐의 온 도를 유지시키는 것으로 나타났다. 역상 컬럼에서 항생제를 분리하기 위한 이동상으로는 극성 용매인 물이 사용되고 비극성 용매로는 메탄올이나 아세토나이트릴 또는 메탄올 과 아세토나이트릴의 혼합액이 사용되는 것으로 나타났다. 모든 방법은 시간에 따라 극성 용매와 비극성 용매의 혼합 비율을 달리하는 구배용출법을 사용하고 있으며 극성이 낮 은 물질이 상대적으로 긴 머무름 시간을 갖는다.

이온화 효율을 향상시키고 질량분석기에서 감도를 높이 기 위한 방법으로 휘발성이 높은 포름산, 포름산암모늄, 초 산암모늄 등을 이동상에 첨가제로 사용하며 검토된 대부분 의 문헌에서 0.05~0.3%의 포름산을 첨가물로 사용하는 것 으로 나타났다. 일부 문헌과 EPA method 1694에서는 테트 라사이클린계열 항생제에 대한 분석 효율을 높이기 위해 옥살산을 첨가하여 감도, 분해능, 반복성 등이 향상되는 것 을 확인하였으나 상대적으로 낮은 휘발성을 갖는 옥살산으 로 인해 기계적인 문제를 일으킬 수 있고, 다 계열의 항생 제를 분석하는 경우에 있어서는 포름산과 초산암모늄을 첨 가제로 사용한 조건에서 모든 항생제에서 높은 분해능과 감도를 나타낸다고 보고되고 있다.

HPLC 또는 UPLC로 분리된 항생제는 이온화 단계를 거 치는데 positive 방식의 전자분무이온화법을 사용하는 것으 로 나타났고 선택반응검출 방식으로 분석대상물질의 농도 를 측정한다. 선택반응검출 방식은 빠른 시간에 정확한 스 크리닝이 가능하여 규칙적이고 지속적인 시료분석에 매우 유용한 것으로 알려져 있다.

분석방법을 개발하여 보고한 문헌들에서는 그 유효성을 검증할 목적으로 검정선의 범위와 선형성, 회수율, 검출한 계 등을 제시하는 것으로 나타났다. 대부분의 연구들은 직 선성을 나타내는 r²이 0.99 이상인 조건의 검량선을 사용하 고 있으며 페니실린 G, 린코마이신, 타이로신 등이 상대적 으로 좋지 않은 회수율을 나타내는 반면 플로로퀴놀론계열, 설폰아마이드계열, 테트라사이클린계열의 항생제는 유효한 회수율을 나타내는 것으로 조사되었다. 보고된 MDL은 물 시료의 경우 ppt 수준, 고체시료의 경우 ppb 수준으로 환경 시료 중에 미량으로 존재하는 잔류 항생제를 검출하는데 충분한 감도를 갖는 것으로 판단된다.

본 연구를 통해 확인된 바와 같이 EPA method 1694를 적용할 수 있는 16종의 동물용 항생제는 동일한 분석방법 의 적용이 가능한 것으로 나타났고, 특히 LC에 적용하는 컬럼의 종류, 이온화 방식 등이 같은 것으로 조사되었다. 따라서 적절한 전처리 과정을 적용할 경우 16종의 항생제 에 대한 동시 분석이 가능하리라 판단된다. 향후 분석 대 상물질의 범위를 확장시키기 위해서는 C₁₈컬럼과 positive 방식의 이온화법으로 분석 가능한 물질들에 대해 우선적으 로 분석법을 적용해 보고 분석 데이터 검증을 통한 적용성 평가가 이루어져야 할 것이다.