2.1 표준 물질 및 시약

별도의 언급이 없는 한, 본 연구에 사용된 모든 시약은 추가적인 정제 과정 없이 분석급(analytical grade) 시약을 그대로 사용하였다. 주요 시약으로는 HEPES 완충제(N-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulphonic acid, H3375), 염화제이철(FeCl₃⋅6H₂O, 220299), 초산나트륨(Sodium acetate, S2889), 피루브산나트륨(Sodium pyruvate, P4562)을 사용했으며, 모든 시약은 Sigma-Aldrich (Burlington, MA, USA)로부터 구입하였다^{(Yoon et al., 2023)}. 모든 용액은 초순수(비저항 ≥ 18.2 MΩ⋅cm, aqua Max-Ultra 370 series purification system, Younglin, Korea)를 사용하여 제조하였다. 배지를 포함한 모든 용액은 고순도 질소(99.9%, N₂)로 충분히 퍼지(purging)하여 혐기 조건을 확보한 후, 세럼 바이알(serum vial)에 주입하고 부틸 고무 마개와 알루미늄 캡으로 밀봉하여 실험에 사용하였다^{(Jiang et al., 2013)}.

2.2 배지 및 배양 조건

혐기성 배양을 위해 30 또는 100 mL의 완충 배지를 세럼병에 분주한 뒤, 고순도 질소(99.9%, N₂)로 충분히 퍼지(purging)하여 용존 산소를 제거하였다. 이후 부틸 고무마개와 알루미늄 캡으로 밀봉하고 121 °C에서 20분간 고압멸균하였다. 접종원 준비를 위해 새만금 국가산업단지 인근 해양 수역의 갯벌 및 해수 시료를 깊이별로 채취하여 HEPES 완충용액에 순차적으로 현탁하였으며, 이 현탁액의 1% (v/v)를 멸균된 배지에 접종하여 혐기 조건에서 배양하였다. HEPES 완충염 배지의 조성 및 준비 절차는 선행 연구에 상세히 기술되어 있다^{(Yoon et al., 2023)}. Fe(III) 전자수용체로 사용된 비정질성 Fe(III)-oxyhydroxide(i.e., Fhy)는 Schwertmann과 Cornell의 방법을 일부 수정하여 합성하였다^{(Lee et al., 2007)}. 즉, 0.4 M 염화제이철(FeCl₃⋅6H₂O) 용액을 10 N NaOH로 적정하여 pH 7로 조정하고, 형성된 암갈색 침전물을 실온에서 24시간 교반하였다. 생성된 침전물은 초순수(비저항 ≥18.2 MΩ⋅cm)로 세 번 세척한 후, 고순도 질소로 퍼지된 상태에서 약 0.7 M 농도로 저장하였다. 배양 시, 전자수용체로는 Fhy(30 mM) 및 Na₂SO₄(50 mM)를 멸균 주사기를 이용해 각각 주입하였다. 전자공여체로는 pyruvate 유기산염을 50 mM 농도로 첨가하였다. 이는 전자수용체(Fhy 및 황산염)의 완전한 환원을 유도하기 위해 pyruvate를 이론적 화학량론(stoichiometry) 대비 과량으로 공급함으로써, 실험 기간 중 탄소원 결핍에 의한 반응 제한을 방지하기 위함이다. Pyruvate는 실제 산업 폐수의 주성분은 아니나, 갯벌 유래 미생물 군집 내 다양한 SRB 및 DIRB 균주들에 의해 공통적으로 이용 가능한 대표적 저분자 유기물(model low-molecular-weight organic substrate)로서, 제어된 환경 하에서 미생물의 대사 활성과 Fe–S 광물 형성 기작을 명확히 규명하기 위한 모델 기질로 적용되었다. 또한, 본 연구의 실험군은 ‘채취 지점(P1, P2)-조합 번호’의 형식으로 명명되었다. 총 105개의 교차 배양군은 2개 지점(P1, P2)의 시료를 대상으로 4종의 전자공여체와 3종의 전자수용체를 체계적으로 조합하여 구성되었으며, 분석 대상으로 선정된 P1-5 등의 코드는 전체 조합 중 Fe–S 전환 반응이 뚜렷하게 발현된 배양군을 식별하기 위해 부여된 번호이다. 모든 배양은 암조건에서 30 °C로 유지하였으며, 세균 군집의 안정적 적응 및 농축을 위해 약 1개월 주기로 신선한 혐기성 배지로 계대 배양하였다. 실험 기간은 예비 배양을 통해 Fhy의 색 변화(적갈색→흑색)가 완료되고 기질 대사가 평형에 도달하는 시점(약 30일)을 기준으로 설정되었다.

2.3 수용상 화학종 및 생성 광물 특성 분석

배양 과정 중 일정 주기마다 세럼병 내 액상 및 슬러리 시료(800 μL)를 혐기성 조건에서 채취하였다. 이후 채취된 시료를 사용하여 이화학 농도와 광물학적 특성을 분석하였다. 배양액의 pH는 pH 미터(Orion Star A211, Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 측정하였으며, 실험 초기(pH 7.0) 대비 최종 시점의 pH 변화를 측정하여 수소이온 농도의 안정성을 확인하였다. 유기탄소원의 잔류 농도는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 분석하였다. 검출에는 Diode Array Detector(DAD) 검출기와 Shodex RSpak KC-811 컬럼(8.0 mm ID × 300 mm)을 사용하였으며, 이동상은 10 mM 인산, 유속은 1 mL⋅min⁻¹, 검출파장은 210 nm로 설정하였다. SO₄²⁻ 농도는 이온크로마토그래프(IC, Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 분석하였으며, 표준 용액으로 검량선을 작성하였다. 형성된 철 나노광물의 특성을 파악하기 위해 슬러리 시료를 탈기된(Deoxygenated) 초순수(비저항 ≥ 18.2 MΩ⋅cm)로 세 번 세척한 후, 15분간 2200 × g에서 원심분리하였다. 잔여 수분은 동결건조하여 제거하였다. 결정상 분석은 X선 회절분석기(XRD, X'Pert PRO MPD, PANalytical, Netherlands)를 이용하였으며, Cu Kα 복사선을 사용하여 2θ = 10°–70° 범위에서 1° min⁻¹의 속도로 주사하였다. 피크 식별은 HighScore ICDD 카드 데이터베이스를 참조하였으며, 주요 참고 결정상은 (α,γ)-FeOOH, FeS, Fe₃S₄, FeS₂ 등으로 하였다^{(Gates-Rector and Blanton, 2019)}. 나노광물의 형태학적 특성은 투과전자현미경(TEM, H7650, Hitachi, Japan)과 주사전자현미경(SEM, Gemini 500, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다. TEM 분석 시료는 Cu 그리드 위에 점적 후 상온 건조하였으며, SEM 분석용 시료는 동결건조 후 10 nm 두께의 Pt 도전층으로 코팅하였다. 가속전압은 20 kV로 설정하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하였고, 세균이 포함되지 않은 무생물 대조군을 동일 조건에서 분석하여 결과를 상호 비교하였다. 본 실험계는 50 mM HEPES 완충액의 작용으로 인해 전 배양 기간 동안 pH 7.0 내외의 안정적인 중성 환경이 유지됨을 확인하였다.

또한, 모든 이화학 분석은 R²값 0.99 이상의 높은 직선성을 가진 검량선을 바탕으로 수행되었으며, 기기 분석 오차 5% 이내의 높은 정밀도와 재현성을 확보하였다. 본 연구에서 제시된 데이터는 엄격하게 통제된 혐기성 항온 조건 하에서 도출된 대표적인 대사 패턴 및 광물 전환 경로를 보여주며, 이는 예비 실험을 통해 확인된 결과와 일관된 경향성을 나타낸다.

Fig. 2. Macroscopic progression of biogenic mineral transformation in augmented sample P1-5 during Fe–S–coupled anaerobic microbial respiration in the presence of ferrihydrite (Fhy). The transition in precipitate color from the initial orange hue of ferrihydrite to progressively darker solids reflects the formation of secondary biogenic iron sulfide minerals over the course of incubation. Panels (a–d) present top-view photographs, and panels (e–h) show the corresponding side-view images obtained on day 0 (a, e), day 8 (b, f), day 16 (c, g), and day 25 (d, h), demonstrating the temporal development of Fe–S mineral phases.

2.4 황산이온 환원 세균의 분리 및 동정

장기간 계대 배양되어온 미생물 군집으로부터 황산이온 환원 기능을 갖는 세균을 선별 분리하기 위하여, 시료는 HEPES 완충염으로 10배 단계 희석(10⁻¹∼10⁻⁶)한 후, 한천을 포함한 최소배지에 30 mM pyruvate, 50 mM ferric citrate 및 50 mM SO₄²⁻를 첨가하여 조제한 고체 배지에 평판 도말하였다. 혐기 조건은 glove box 내에서 유지하였으며, 배양은 30 °C에서 수행하였다. 배양 후 형성된 집락 중 약 200개를 무작위로 선별하여, 동일 조성의 액체 배지로 접종하였다. 이들 중 SO₄²⁻를 빠르게 환원하는 균주를 선별하여 SRB와 DIRB로 구분하여 진행하였다. 순수 분리된 균주는 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 계통학적으로 동정하였다. 염기서열 증폭은 domain-specific primer 세트(27F/1492R)를 이용하였으며, 표준 프로토콜에 따라 PCR을 수행하였다. 증폭된 염기서열은 GenBank의 BLASTN 알고리즘을 사용하여 상동성이 높은 근연종과 비교하였고, 각 균주의 계통적 위치는 MEGA X 프로그램을 이용해 Neighbor-Joining 방법으로 분석하였다^{(Tamura et al., 2011)}.

3.1. Fe–S 결합 미생물 활성에 따른 광물전환의 거시적 변화

본 연구에서는 새만금 국가산업단지 인근 장항 갯벌(P1, P2)에서 확보한 30여 개의 표층 시료를 기반으로, 전자공여체(Formate, Acetate, Lactate, Pyruvate)와 전자수용체(Fhy, akaganeite, SO₄²⁻)의 조합을 체계적으로 배열하여 총 105개의 교차 배양군(i.e., crossed electron-donor/acceptor combinations)을 구성하였다. 이러한 교차 배양 설계는 갯벌 미생물 군집 내에서 철 환원균(DIRB)과 황산염 환원균(SRB)이 어떠한 조건에서 Fe–S 연계 반응을 촉진하는지를 평가하기 위함이며, 특히 두 기능군 간 상보적 환원 경로(cooperative Fe–S coupling)가 실제로 발현되는 조건을 선별하는 데 목적을 두었다.

DIRB와 SRB가 공존하는 혐기적 환경에서는 ^{Ke, Guo et al. (2023)}, ^{Ke (2024)}의 선행 연구가 보여주듯, Fe(III) 광물이 미생물 매개 환원에 의해 Fe(II)를 생성하고, 동시에 SRB의 SO₄²⁻ 환원으로 생성된 sulfide와 반응하여 Fe–S 광물(FeS, FeS₂ 등)로 빠르게 전환되는 동시적 환원–석출 경로가 지배적으로 작동한다. 특히 본 연구에서 유지된 중성 pH(약 7.0) 조건은 이러한 생지화학적 전환을 가속화하는 핵심 요소로 작용한다. 해당 pH 범위는 본 연구에서 우점종으로 확인된 Vibrio spp. 및 Aeromonas hydrophila 등 통성 혐기성 미생물들의 최적 활성을 지원하여 원활한 Fe(III) 및 황산염 환원을 유도한다. 또한, 이러한 중성 환경은 미생물의 산화환원 활동을 통해 초기 생성된 황화철이 황철석(Pyrite, FeS₂) 등의 안정된 결정질 광물상으로 전이되는 과정을 직접적으로 매개하는 데 최적의 조건을 제공한다^{(Thiel et al., 2019)}. 이러한 연계 반응은 고체상의 색 변화, 침전물 조성 변화, 광물상 재배열을 유도하는 주요 메커니즘으로 보고되고 있으며, 본 연구에서도 유사한 패턴이 관찰되었다. 특히, 이 과정에서 DIRB에 의해 공급되는 Fe²⁺는 SRB의 대사 산물인 자유 황화물을 즉각적으로 제거함으로써, 황화물 축적에 따른 미생물 독성(sulfide toxicity)을 완충하여 SRB의 지속적인 대사 활성을 가능케 하는 상호완충 메커니즘(Inter-buffering mechanism)으로 작용한다. 총 105개의 배양군 중, Fhy를 전자수용체로 포함한 배양군에서 현저한 고체상 변화가 반복적으로 나타났으며, 이들 중에서도 Fe–S 전환 메커니즘을 가장 명확하게 대변하는 세 가지 대표 실험군(P1-5, P1-18, P2-30)을 최종 분석 대상으로 선정하였다. 여기서 각 코드는 시료 채취 지점과 전자공여체-수용체 조합에 따른 고유 식별 번호를 의미하며(상세 구성 원칙 2.2절 참조), 특히 P1-5는 가장 신속한 흑색화 전환과 높은 황산염 제거 효율을 나타내어 후속 기기 분석(TEM, SEM, XRD)의 중점 시료로 활용되었다.

(1) 육안 관찰 단계에서 Fhy 특유의 적갈색이 빠른 시간 내 회흑색–흑색으로 변화하며, 이는 Fe(III) 환원 및 Fe–S 광물 형성을 반영하는 대표적 지표로 간주된다. (2) Fhy 고체상이 단기간에 미생물 매개 환원 및 광물학적 전환을 통해 구조⋅조성 변화를 나타내며, 이 과정에서 Fe(II) 생성 및 sulfide 반응 가능성을 뚜렷하게 제시하였다. (3) 동일 조건에서의 반복 계대배양 시에도 색 변화 및 침전물 특성이 재현성 있게 유지되어, 생지화학적 반응 경로가 안정적으로 지속됨을 확인하였다.

Fig. 2에 제시한 P1-5의 육안 이미지는 Fhy의 초기 적갈색(0일차)에서 8일차 이후 어두운 회흑색–흑색으로 전환되는 뚜렷한 경향을 보여주며, 이는 미생물 매개 Fe(III) 환원과 SRB 유래 sulfide가 결합된 Fe–S 전환 메커니즘이 실험계에서 효과적으로 발현되었음을 시사한다. 특히 상⋅측면 이미지를 동시에 비교하면, 초기 분산된 Fhy 슬러리가 시간이 지남에 따라 응집된 Fe–S 미세입자로 재구성되는 거시적 변화를 확인할 수 있으며, 이는 정성적 분석에서 규명될 미세구조적 변형의 기초적 근거를 제공한다.

3.2. 피루베이트 기반 Fe–S 연계 미생물 대사와 전자수용체 환원 동역학

Fig. 3은 대표 컨소시엄(P1-5, P1-18, P2-30)에 대한 피루베이트 소비, 아세트산 생성, 및 황산염 농도 변화를 시간축으로 정량화한 결과로서, 피루베이트 기반 혐기성 대사가 Fe–S 연계 환원 반응을 어떻게 촉발⋅지속시키는지를 평가하는 핵심 데이터이다. 실험은 모두 동일 조건(30 mM Fhy, 50 mM SO₄²⁻, 50 mL septum-vial, 30 °C 정치배양)에서 수행되었으며, 각 실험군은 무접종 대조군과 병행하여 상대적 변화를 비교할 수 있도록 구성하였다. 그 결과, 피루베이트 분해 경로와 연계된 전자 흐름은 미생물 군집의 기능적 구성 및 전자수지(electron balance)의 분배 방식에 따라 뚜렷하게 구분되는 대사⋅환원 패턴을 나타냈다.

첫째, 피루베이트 소비 속도는 세 컨소시엄에서 매우 빠르게 나타났다. 관측값에 따르면 피루베이트는 배양 1∼5일 내에 전량(≈100%) 소모되었으며(Fig. 3a, c, e), P1-5에서 특히 초기 소모가 가장 신속하였다. 이러한 초기 고갈 양상은 본 실험계의 혼합 해양성 컨소시엄이 피루베이트를 우선적 전자공여체로 이용하여 빠르게 환원력(저분자 환원물 및 H₂ 등)을 생성했음을 시사한다. 다만 초기 24시간 이내의 샘플링이 이루어지지 않아 소모 속도의 세부 시계열(예: 0∼6 hr, 6∼24 hr)에 대한 정량적 판단은 제한적임을 명확히 한다.

둘째, 피루베이트 산화의 일차적 부산물로 관찰된 아세트산은 각 컨소시엄에서 축적 양상에 차이를 보였다. P1-5에서는 피루베이트의 급격한 소모에 따라 아세트산 축적이 거의 비례적으로 일어났고(예: 초기 전환율 ≈94% 수준 관찰), 이후 배양 후기에는 아세트산 농도가 점차 감소하는 경향을 보였다(예: 7일 76% → 18일 66% → 25일 60%로 상대적 감소). 반면 P1-18과 P2-30은 초기 아세트산 축적률이 낮거나 중기까지 점진적으로 증가한 뒤 후기에 다시 감소하는 패턴을 보였다(예: P1-18: 초기 53% → 15일 90% → 후기 73%로 일부 감소). 이러한 차이는 (i) 발효균과 syntrophic 파트너의 상대적 분포, (ii) 아세트산을 전자공여체로 이용하는 acetotrophic SRB 또는 DIRB의 활성화 시점, (iii) hydrogenotrophic 소비 경로 등 복수의 대사경로가 시간에 따라 전자 흐름을 재분배하기 때문으로 해석된다. 특히 P1-18과 P2-30의 경우, 생성된 아세트산이 액상에 축적되지 않고 곧바로 후속 환원 반응(Fe(III) 및 SO₄²⁻환원)의 전자공여체로 투입되는 전자 흐름의 효율적 분배가 초기부터 활발히 진행되었음을 시사하며, 이는 결과적으로 아세트산 축적률을 낮추는 동시에 고체상 Fe–S 전환을 가속화하는 동력이 되었다. 즉, 아세트산의 축적과 이후 감소는 단순 생성⋅축적 과정이 아니라 후속 전자수용체(황산염⋅Fe(III))에 대한 소비로 이어지는 동적인 탄소흐름의 지표이다.

셋째, SO₄²⁻의 시간적 거동은 컨소시엄별로 차이를 보이면서도 Fe–S 색 변화와 강한 상관을 나타냈다. 배양 초기(2~5일) 황산염의 급격한 감소는 P1-5에서 약 74% 감소, P1-18 약 73% 감소, P2-30 약 63% 감소로 관측되었고, 장기적으로는 P1-5에서 최종적으로 약 40–60% 수준의 환원(또는 제거)이 관찰되었다. P1-18과 P2-30은 상대적으로 안정된 제거율(대략 60–70% 대)을 유지하였다. 이러한 패턴은 피루베이트 발효로부터 생성된 전자(또는 전구체; acetate, H₂ 등)가 SRB에 의해 SO₄²⁻ → HS⁻로 환원되었고, 동시에 DIRB에 의해 발생한 Fe²⁺와 결합하여 Fe–S 침전이 유도되었음을 시사한다. 특히 황산염 제거 정도와 Fig. 2의 슬러리 색 변화(흑색화) 사이의 높은 일치성은 황산염 환원이 Fe–S 광물 형성의 주요 동인임을 지지한다. 다만, 피루베이트가 배양 초기 전량 소모되었음에도 황산염 제거율이 60–70% 수준에서 제한된 것은, 공급된 50 mM의 피루베이트가 제공하는 총 전자량(electron equivalent) 중 상당 부분이 공존하는 30 mM의 Fhy(Fe(III))를 Fe(II)로 환원시키는 데 우선적으로 소비되었기 때문으로 판단된다. 즉, 화학량론적으로 한정된 전자공여체가 철과 황산염 두 전자수용체로 분배됨에 따라 황산염의 완전한 환원을 위한 환원력이 충분치 않았음을 시사하며, 이는 미생물 군집 내에서 DIRB와 SRB 간의 전자 확보 경쟁 및 상호작용을 뒷받침하는 근거가 된다.

그러나 일부 시점에서 관찰된 황산염 농도의 소폭 증가 또는 변동성(예: P1-5 후기 소폭 증가, P1-18의 일시적 감소폭 등)은 환원-산화의 가역적 전환, 중간 황종(polysulfide, S⁰, sulfite 등)의 생성⋅전환, 또는 고체상과 용존상 간의 흡착⋅탈착 현상 등 복합적 과정이 개입되었을 가능성을 제기한다. 예컨대 HS⁻이 Fe(III) 표면에서 중간 산화생성물(S⁰, polysulfide)을 형성하거나, 미세산소⋅산화적 미세영역에서 일부 S⁰가 부분 산화되어 측정상 SO₄²⁻로 회귀하는 경우가 있을 수 있다. 이러한 경우는 황의 전체 물질수지(sulfur mass balance)를 확보하지 못하면 오해를 초래할 수 있으므로 신중한 해석이 필요하다.

마지막으로, 본 연구의 해석은 여러 보완적 증거(광물 색 변화, 기질⋅대사산물의 시계열 변화, 후속 TEM/SEM/XRD에서 확인될 미세구조⋅상 변화)에 의해 지지되나, Fe–S 연계 반응의 구체적 경로(예: Fe(III) 환원 속도, Fe²⁺ 정량 측정, HS^-의 동시 생성량 및 중간황종의 시계열 분포)를 정량적으로 규명하기 위해서는 추가 실험이 필요하다. 권장 보완 실험으로는 (i) 용존 Fe²⁺(ferrozine법) ^{(Stookey, 1970)} 및 배양시간 기반 총황화물(H₂S/HS^-) 분해 측정^{(O’Dwyer et al., 2003)}, (ii) sulfite⋅thiosulfate⋅polysulfide 등 중간황종의 분석(IC/HPLC, S K-edge XANES), (iii) 고체상 황⋅철의 화학결합 상태 규명을 위한 XPS/Raman 및 sequential extraction, (iv) 동위원소 추적(예: ³⁴S, ¹³C) 기반의 전자흐름 인과관계 규명 등이 있다. 이러한 보완을 통해 피루베이트 투입에 따른 전자수지(electron balance)를 정립하고, Fe–S 광물 핵생성 및 성장 메커니즘을 보다 정확하게 모델링할 수 있을 것이다.

종합하면, Fig. 3의 정량적 결과는 P1-5, P1-18, P2-30 컨소시엄에서 피루베이트 기반의 빠른 발효가 SRB를 활성화시키고, 이와 동시⋅연계하여 DIRB에 의한 Fe(III) 환원과 Fe–S 침전이 진행되었음을 강력히 시사한다. 비록 결정적 중간종의 직접 측정은 미흡하나, 현장 유래 혼합군에서 관찰된 기질⋅황종⋅광물상의 통합적 변화는 DIRB–SRB 간의 실질적 상호작용과 Fe–S 연계 환원이 실험계의 주요 반응 경로임을 뒷받침한다^{(Ke, Zhang et al., 2023)}.

Fig. 3. Temporal profiles of (a, b) P1-5, (c, d) P1-18, and (e, f) P2-30 for substrate consumption (pyruvate; grey circles) and the corresponding metabolic byproduct formation (acetic acid; violet triangles), along with (b, d, f) sulfate ion concentrations during anaerobic incubation in 50 mL septum-sealed vials supplemented with 30 mM ferrihydrite (Fhy) and 50 mM sulfate (SO42-). Lines represent direct connections between measured data points.

3.3. TEM 기반 Fe–S 생지화학적 광물전환의 미세구조 및 조성 변화

TEM 분석 결과, 피루베이트 기반 혐기성 미생물 호흡 과정에서 Fhy의 구조적⋅조성적 변화가 명확하게 관찰되었다(Fig. 4). 초기(0일차)의 Fhy는 직경 <5 nm의 매우 작은 나노입자들이 무정형(amorphous)에 가깝게 집합한 형태를 보였으며(Fig. 4a), SAED 패턴에서도 명확한 회절링이 나타나지 않아 낮은 결정성을 특징으로 하였다(Fig. 4b).

16일차 분석(Fig. 4c)에서는 Fhy 입자들이 점차 응집⋅성장하면서 부분적으로 구분되는 나노립질(nanograin) 구조가 발달하였고, SAED 패턴(Fig. 4d)에는 약하게 정렬된 회절링이 확인되어 미생물 반응에 의해 초기 Fe–S 전구체 성분이 형성되기 시작함을 시사한다. 이 시점에서는 아직 명확한 결정상의 형성보다는, 미세 수준의 구조 재배열 및 입자 간 집합체(coherent aggregates)의 발달이 주요 특징으로 나타났다. 25일차 TEM 이미지(Fig. 4e)는 Fhy 기반 광물이 크게 재구성되어, nanorod 모양의 세장형 입자들과 framboid-like(라즈베리 모양) 미세구조가 광범위하게 출현하는 것으로 나타났다. 이러한 형태는 일반적으로 Fe–S 광물(예: mackinawite, greigite) 형성과정에서 나타나는 특징적 형태(morphology)로 알려져 있으며, 본 실험계에서도 Fe–S 연계 미생물 대사에 의해 유도된 2차 광물전환이 진행되었음을 보여준다. SAED 패턴(Fig. 4f)에서도 보다 선명한 다중 회절링이 관찰되어, 시간 경과에 따라 결정성이 향상된 Fe–S 상이 형성되었음을 확인할 수 있었다.

STEM–EDS 매핑(Fig. 4g–i)은 변환된 광물 입자 전역에서 Fe와 S가 공간적으로 뚜렷하게 공존(co-localization)함을 보여주며, 전체적인 원소 조성은 Fe 68%, S 32%의 비율로 나타났다. 이러한 조성은 pyrite(FeS₂)의 이론적 화학량론적 비율에 비해 철의 함량이 높으나, 이는 본 연구에서 형성된 광물이 단일 상이 아닌 mackinawite(FeS)에서 pyrite로 전이되는 과정 중 형성된 다양한 황화철 복합상(mixed phases)이 혼재된 결과로 판단된다. 특히 XRD 결과(Fig. 6c)에서 확인된 바와 같이, 미생물 대사에 의해 생성된 초기 황화철이 점진적으로 pyrite로 전이되는 중간 단계의 광물들이 공존하고 있음을 시사한다. 이는 미생물 호흡 과정에서 유기 전자공여원인 피루베이트가 환원력을 공급하고, S-함유 종이 동시에 전환되며 Fe–S 기반의 바이오생성 광물이 형성되었음을 뒷받침한다.

Fig. 4. Transmission electron microscopy (TEM) characterization of biogenic mineral transformations in sample P1-5 during Fe–S–coupled anaerobic microbial respiration in the presence of ferrihydrite (Fhy). Panels (a), (c), and (e) present TEM micrographs acquired on day 0, day 16, and day 25 of incubation, respectively, illustrating the progressive transition from the initially amorphous ferrihydrite matrix to aggregated Fe–S nanomineral assemblages. The associated selected-area electron diffraction (SAED) patterns in (b), (d), and (f) document the structural evolution from poorly ordered Fhy to increasingly crystalline Fe–S phases. STEM–EDS elemental maps of (g) Fe and (h) S, along with the merged Fe–S distribution shown in (i), confirm the spatial co-localization of Fe and S within the biogenic precipitates.

3.4. SEM 기반 Fe–S 연계 미생물 반응에 의한 표면 미세구조 변화

SEM 분석을 통해 피루베이트 기반 혐기성 미생물 호흡 과정에서 Fhy의 표면 형태가 시간에 따라 뚜렷하게 변형되는 양상이 관찰되었다(Fig. 5). 초기(0일차) 시료(Fig. 5a)는 <5 nm 크기의 Fhy 나노입자들이 촘촘하게 집합한 미세한 미분상(amorphous-like fine particulate) 표면을 보이며, 구조적 조직화가 거의 이루어지지 않은 전형적인 비정질 Fhy 특성이 확인되었다.

16일차 SEM 이미지(Fig. 5b)에서는 Fhy 기반 입자들이 서로 응집하면서 보다 뚜렷한 나노립질(nanogranular) 조직으로 성장하였고, 일부 영역에서는 판상 또는 클러스터 형태의 초기 Fe–S 전구체 구조가 발달하기 시작하였다. 이는 TEM에서 확인된 미세 수준의 구조 재배열과 일관된 결과로, 미생물 대사에 의해 Fe 및 S 종이 점차 재조합되며 표면 수준에서의 조대화(coarsening)가 진행되고 있음을 시사한다. 25일차(Fig. 5c)에서는 광물 표면이 현저히 재구성되어, 입체적이고 다면체 형태의 집합체가 형성되었으며, 일부 영역에서는 전형적인 Fe–S 기반 2차광물에서 흔히 관찰되는 조대화된 응집체 및 불규칙한 판상 구조가 뚜렷하게 확인되었다. 이러한 형태 변화는 Fhy가 미생물 매개 환원과 S-함유 종의 동시 참여로 인해 Fe–S 광물로 전환되었음을 명확히 보여준다. EDS 매핑 결과(Fig. 5d–f)는 재구성된 광물 입자 전역에서 Fe와 S가 공간적으로 강하게 공존(co-localization)함을 나타내며, 분석된 영역의 대표 조성은 Fe 73%, S 27%로 측정되었다. 앞선 TEM 분석과 마찬가지로 철의 농도가 상대적으로 높게 산출되는 경향을 보였는데, 이는 초미세 나노광물 시료의 특성상 분석 시 하부의 미처 반응하지 않은 철 수산화물 기질(matrix) 성분이 일부 포함되었거나, 열역학적으로 안정된 단일 상이 형성되기 전의 과도기적 상들이 복합적으로 존재하기 때문인 것으로 해석된다. 이는 TEM 기반 분석과 정합되는 결과로, 미생물에 의해 유도된 Fe–S 광물전환이 시료 표면 전반에서 일관되게 진행되었음을 보여준다.

Fig. 5. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of biogenic mineral transformation in sample P1-5 during Fe–S–coupled anaerobic microbial respiration in the presence of ferrihydrite (Fhy). Panels (a), (b), and (c) present SEM micrographs obtained on day 0, day 16, and day 25 of incubation, respectively, illustrating the progressive transition from the initially amorphous ferrihydrite matrix to aggregated Fe–S nanomineral assemblages. Panels (d) and (e) show FE-SEM EDS elemental maps of Fe and S, respectively, and the merged Fe–S map in (f) demonstrates their spatial co-localization within the biogenic precipitates. The representative bulk elemental composition of the mapped region is 73% Fe and 27% S.

3.5. XRD 기반 미생물 매개 Fe–S 광물전환의 결정구조 변화

XRD 분석을 통해 Fhy가 미생물의 Fe–S 연계 환원대사에 의해 시간 경과에 따라 단계적으로 결정구조를 재편하는 과정이 확인되었다(Fig. 6). 초기 0일차 시료(Fig. 6a)는 전형적인 비정질 Fhy 패턴을 나타내며, 낮은 결정성에 기인한 넓고 퍼진 회절 피크(예: 2θ ≈ 35°, 62° 부근)가 관찰되었다. 이는 <5 nm 크기의 비정형 Fhy 1차 입자들로 구성된 초기 미세구조와 일관된 결과이다.

10일차 시료(Fig. 6b)에서는 Fhy가 부분적으로 구조화되며, α-FeOOH 및 γ-FeOOH에 해당하는 준결정(semi-crystalline) Fe(III) oxyhydroxide 상들이 출현하였다. 2θ ≈ 26–36° 및 45–55° 영역에서 상대적으로 뚜렷해진 피크가 확인되며, 이는 미생물 호흡 과정에서 생성된 환원성 대사산물과 전자수용체(SO₄²⁻, Fe(III)) 간 경쟁⋅분배 조절에 의해 Fhy의 재배열이 부분적으로 이루어진 결과로 해석된다. 23일차(Fig. 6c)에서는 Fe–S 기반의 결정성 광물상이 우세하게 나타났으며, mackinawite(FeS), pyrite/marcasite 계열(FeS₂)에 부합하는 결정면들(예: (111), (200), (311), (321), (731))이 선명한 고강도(high-intensity) 피크로 관찰되었다. 이때 관찰된 주요 회절 피크들은 표준 결정질 시료에 비해 상대적으로 넓은 반치폭(FWHM, Full Width at Half Maximum)을 나타냈으며, 이는 Scherrer equation($\tau = K\lambda / \beta\cos\theta$)의 원리에 따라 형성된 광물이 수 나노미터(nm) 수준의 초미세 결정립들로 구성되어 있음을 시사한다. 이러한 XRD 피크의 확산(broadening) 특성은 TEM 분석을 통해 확인된 나노 크기의 입자 형태와 잘 부합하며, 결과적으로 미생물 대사에 의해 생성된 황화철이 나노 결정질(nanocrystalline) 상태임을 정성적으로 뒷받침한다. 이 시점에서 Fe(III) oxyhydroxide 신호는 거의 소멸하였고, Fe–S 광물의 결정성 발달이 지배적인 것으로 나타났다. 이는 TEM⋅SEM 결과에서 확인된 형태적 재조직화 및 Fe–S 공분포 패턴과 직접적으로 대응한다. 전반적으로 XRD 분석은 Fhy가 비정질 → 준결정 Fe(III) oxyhydroxide → 결정성 Fe–S 나노광물로 단계적으로 전환되는 명확한 광물변환 경로(mineralogical trajectory)를 제시한다. 이는 미생물군집의 피루베이트 기반 환원대사가 Fe와 S의 동시적 재배치를 유도함으로써 일관된 구조적⋅화학적 진화를 촉진함을 보여준다.

Fig. 6. X-ray diffraction (XRD) patterns of the initial ferrihydrite (Fhy) and biogenically transformed minerals in sample P1-5. Shown are diffraction profiles for (a) pristine ferrihydrite (red-brown; corresponding to Fig. 2a), (b) semi-crystalline Fe(III) oxyhydroxide phases produced during biotransformation (yellow–green; corresponding to Fig. 2b–c), and (c) crystalline iron–sulfur nanominerals (dark black; corresponding to Fig. 2d).

3.6. 배양 기반(culture-dependent) 접근을 통한 Fe–S 환원성 미생물 군집 특성 분석

시료 P1-5에서 유래한 농축 미생물 컨소시엄의 상등액(supernatant)과 침전 슬러리(sedimented slurry) 분획에 대해 배양 가능한 미생물 군집 구조를 분석하였다. 각 분획에서 50개 이상 균주를 혐기성 조건 하에서 피루베이트(30 mM)와 황산염(50 mM)이 포함된 한천배지에 접종하여 분리⋅동정하였으며, 분획별 분리 균주의 상대적 비율을 통해 군집 구성을 파악하였다(Fig. 7).

상등액 분획에서는 Vibrio parahaemolyticus(38%, Accession No. CP009765.1)가 가장 높은 비율을 차지했으며, 이어서 Vibrio spp.(23%, Accession No. KU670109.1), Vibrio fluvialis (15%, Accession No. KX002034.1), Aeromonas hydrophila (13%, Accession No. GQ331029.1), Vibrio alginolyticus(11%, Accession No. CP006718.1) 순으로 확인되었다. 반면, 침전 슬러리 분획에서는 V. parahaemolyticus(61%)와 Vibrio spp.(39%)가 대부분을 차지하여 입자 또는 표면에 대한 강한 부착⋅연관성을 나타냈다.

전통적으로 Vibrio 속은 혐기적 이분해를 기반으로 성장하는 호기⋅혐기성 통성미생물로 알려져 있으나, 최근 여러 연구에서 일부 Vibrio spp., 특히 V. parahaemolyticus, V. fluvialis, V. alginolyticus 등이 혐기성 조건에서 Fe(III)를 환원하는 능력을 갖는 것으로 보고된 바 있다^{(Lovley, 1997)}. 이는 외막 시토크롬 활용 또는 용해성 전자전달 매개체를 통한 전자전달 기작과 관련된 것으로 알려져 있다. 특히 본 연구에서 분리된 Vibrio spp.는 전형적인 해양성 세균으로서 높은 이온 강도와 염분 조건에서도 대사 활성을 유지할 수 있는 내염성(halotolerant)을 지니고 있다. 이들은 세포외 전자전달(EET)을 통해 불용성 Fe(III)를 환원하여 Fe²⁺를 안정적으로 공급할 뿐만 아니라, 세포 표면이 황화철 입자의 핵생성을 돕는 생물학적 템플릿(template) 역할을 수행함으로써 생지화학적 광물 전환을 가속화한다. 또한 일부 Vibrio 균주는 티오황산염⋅아황산염 환원 또는 시스테인 대사 경로를 통해 황화물을 생성할 수 있어, 황환원 기반의 SRB 유사 기능을 수행하며 국지적 환원⋅황화 환경 조성에 기여할 수 있음이 문헌에서 확인되어 왔다. 이러한 점을 고려할 때, 입자 연관성이 높은 V. parahaemolyticus 및 기타 Vibrio spp.는 Fe(III) 환원 및 2차적인 Fe–S 광물전환 과정에 기여했을 잠재력을 가진다. 다만, 본 분석 결과는 특정 고체 배지 조건에서 분리 가능한 균주들에 국한된 것으로, 실제 배치 반응계 내에서 황산염 환원을 주도하는 전형적인 비배양성 SRB의 존재를 완전히 배제하기는 어렵다. 따라서 이들 분리 균주는 시스템 내에서 직접적인 환원뿐만 아니라, 유기물 분해 및 환원력 공급을 통해 전반적인 Fe–S 연계 반응을 지원하는 기능성 후보군(functional candidates)으로 해석하는 것이 타당하다. 한편 상등액에서 동정된 Aeromonas hydrophila는 환경 중에서 널리 보고되는 대표적인 해양⋅담수성 Fe(III) 환원 미생물로, 본 연구에서 확인된 Fe–S 연계 미생물 반응에 기여할 수 있는 균주로 평가된다^{(Tao et al., 2017)}.

종합하면, 본 배양 기반 분석에서는 V. parahaemolyticus, Vibrio spp., Aeromonas와 같은 통성혐기성 미생물들이 배양 가능한 분획 내에서 우점하는 것으로 나타났다. 이들은 Fe(III) 환원 및 잠재적인 황 변환 능력을 보유하고 있어, 본 연구에서 관찰된 Fe–S 광물전환 과정에서 보조적인 기여자로 작용했을 것으로 판단된다. 비록 전형적인 SRB의 직접적인 동정에는 한계가 있었으나, 확보된 균주들의 대사 활성은 해양 컨소시엄 내 복합적인 미생물 상호작용의 일면을 보여주며, 이는 향후 비배양성 군집 분석을 통해 보다 명확히 규명될 필요가 있다.

Fig. 7. Relative abundance of bacterial species isolated from enriched microbial consortia in supernatant and sediment fractions of sample P1-5. Bacterial isolates were obtained by cultivation on solidified agar medium supplemented with 30 mM sodium pyruvate and 50 mM sodium sulfate under anaerobic conditions. Relative abundance was determined by calculating the proportion of each bacterial species among the total number of isolates recovered from each consortium fraction (n > 50 isolates per fraction). Data represent the taxonomic composition of culturable bacteria from sulfate-reducing microbial communities.

3.7. 환경학적 함의 및 향후연구 시 고려사항

이차전지 산업의 급속한 확장에 따라 고농도의 황산염을 함유한 산업폐수의 발생량이 증가하고 있으며, 일부 지역에서는 이러한 폐수의 처리⋅처분 방안으로 해양 배출을 검토하는 사례가 늘고 있다. 이러한 맥락에서, 본 연구에서 규명된 Fe–S 연계 미생물 호흡과 Fe–S 나노광물 형성 메커니즘은 해양 및 연안환경에서의 황산염⋅철 순환, 금속 안정화, 그리고 잠재적 부영향(예: 황화물 독성 및 금속 재동원 가능성)을 예측하는 데 중요한 환경학적 시사점을 제공한다.

미생물 매개 황산염 환원은 필연적으로 황화수소(H₂S), 아황산염(SO₃²⁻), 용존 황화물(HS⁻, S²⁻) 등을 생성할 수 있으며, 이들은 낮은 농도에서도 높은 생태독성을 나타낸다. 또한 생성된 황화물은 해수 내 금속 이온과 반응하여 불용성 금속 황화물을 형성함으로써 금속의 생물유효성과 이동성을 크게 변화시킬 수 있다. 따라서 본 연구 결과는 해양투기 또는 연안⋅조간대 배출 시 발생 가능한 미생물⋅광물학적 반응 경로를 사전에 예측하고, 오염원의 장기적 고정⋅재동원, 지하수 및 퇴적물의 산화환원 구조 변화, 금속⋅공오염물의 환경거동 평가에 핵심적 근거를 제공한다.

특히, 본 연구에서 규명된 Fe–S 광물화 과정은 고농도 폐수 내 용존 황산염을 불용성 나노광물로 전환하여 고정하는 ‘Biological Sulfur Fixation’ 경로를 제시한다. 이는 기존의 증발-결정화 공정 대비 저에너지 조건에서 황산염을 안정적인 고체상으로 분리⋅회수할 수 있음을 의미하며, 생성된 Fe–S 나노광물은 공정 내에서 중금속 흡착제나 촉매 등으로 재활용될 수 있어 자원 순환형 폐수 처리 시스템(resource-recovery wastewater treatment) 구축을 위한 공정적 타당성을 제공한다.

실제 이차전지 제조 및 재활용 공정에서 발생하는 폐수는 일부 화학 공정을 거치면서 높은 온도를 나타낼 수 있으나, 생물학적 처리 공정으로 유입될 때에는 별도의 온도 제어 없이 외기 및 유입수 조건의 영향을 받아 비교적 완만한 온도 범위에서 운전되는 경우가 일반적이다.

따라서 본 연구에서 설정한 30 °C 배양 조건은 미생물 활성 평가를 위한 대표적 중온성(mesophilic) 실험 조건으로서 설정되었으며, 확보된 해양 유래 미생물 군집은 고염분(Na₂SO₄ 등) 성상의 폐수에서도 안정적인 황산염 환원 및 Fe-S 광물 고정화를 수행할 수 있는 실질적인 잠재력을 가진다. 향후 이러한 미생물 촉매 시스템을 활용한다면 폐수 내 황산염 제거와 동시에 생성된 Fe-S 나노광물을 중금속 흡착제로 재활용하는 자원 순환형 처리 공정 구축이 가능할 것으로 기대된다.

본 연구는 특정 유기 전자공여체(pyruvate)를 사용한 합성 배지 조건 하에서 Fhy 기반 Fe–S 광물전환 기작을 정밀하게 규명함으로써, 고농도 황산염 폐수의 생물학적 전환에 대한 개념적 타당성(conceptual feasibility)을 입증하였다. 그러나 실제 산업 폐수는 다이온성 염, 중금속, pH 변동성 및 복합 유기물을 포함하는 복잡계(complex system)이므로, 본 실험 결과를 산업 공정에 직접적으로 확장 적용하기에는 일정한 제한이 있다. 따라서 실제 환경 조건에서의 반응속도, 전자수용체 간 경쟁, 미생물 군집 조성의 시간적 변동성 등은 향후 보완이 필요한 핵심 요소로 남아 있다. 특히 황화물 생성에 따른 생태독성 및 금속 안정화 효과를 정량적으로 평가하기 위해서는 H₂S dynamics, 금속–황화물 결합의 장기 안정성, 형성된 Fe–S 나노광물의 용출⋅재산화 거동에 대한 후속 연구가 요구된다. 더불어, 메타지노믹스(metagenomics)와 같은 비배양 기반 접근을 병행할 경우 배양 불가능한 미생물의 기능을 포함하여 보다 완결된 생지화학적 모델 구축이 가능해질 것이다.

향후 연구는 (i) Fe–S 나노광물 형성의 반응속도론적 규명, (ii) 황화물 생성 및 독성 영향의 정량화, (iii) 금속 및 공오염물과의 상호작용 메커니즘 해석, (iv) 실제 폐수⋅지하수⋅퇴적물 시스템에서의 적용 가능성 검증 등을 포함하여, 미생물–광물–환경 간 상호작용을 통합적으로 설명할 수 있는 환경지화학적 기반을 확장해 나가야 한다.